發(fā)布時(shí)間：2018-12-12 08:25

【摘要】：目的： 建立內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法套路,探索載脂蛋白A1模擬肽R-D4F對內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附、遷移活性的影響。 方法： 1.單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)分離、培養(yǎng) 采用Ficoll-hypaque(葡聚糖—泛影葡胺)密度梯度離心法,從人臍靜脈血中分離出MNCS.重懸于EGM-2完全培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度,接種在已包好人纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。 2.內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)至20d后,進(jìn)行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞吞噬Dil-ac-LDL及膜內(nèi)表面結(jié)合FITC-UEA-I的能力。 3.載脂蛋白A1(APOA1)模擬肽R-D4F對EPCs黏附功能的影響 培養(yǎng)3-4周的EPCs分為5組,分別為DMEM組、D-4F(50μg/ml)組、R-D-4F(5μg/ml,10μg/ml,50μg/ml)組。加入干預(yù)藥物后將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24h。胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,接種于人纖維連接蛋白包被的24孔培養(yǎng)板中。每組6孔,每孔500μl。各組隨機(jī)3孔37℃孵育2h,另外3孔37℃孵育4h。顯微鏡下每孔隨機(jī)選擇8個(gè)視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞,取平均值。檢測5組細(xì)胞的黏附功能有無變化并比較有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.載脂蛋白A1(APOA1)模擬肽R-D4F對EPCs遷移功能的影響 用24孔transwell(孔徑8μm)行體外遷移實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)3-4周的EPCs用胰酶消化后重懸于完全培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/ml。transwell下室先加600μ1EGM-2培養(yǎng)基,再根據(jù)分組加入不同的干預(yù)藥物。上室中加細(xì)胞懸液100μl。將24孔板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育12h。經(jīng)固定、染色、洗滌后,每個(gè)小室隨機(jī)選擇10個(gè)連續(xù)顯微鏡視野(200倍)計(jì)數(shù)遷移到上室膜下的細(xì)胞。 主要結(jié)果： 1、MNCs的分離、培養(yǎng) 4d后首次換液,輕輕吸棄未貼壁細(xì)胞。一周左右即可見到貼壁細(xì)胞小集落,細(xì)胞呈長橢圓形。一周后細(xì)胞生長明顯加速,呈克隆樣生長,逐漸出現(xiàn)大面積團(tuán)簇狀生長,細(xì)胞呈放射條索狀排列。20d左右細(xì)胞已基本長滿瓶底70-80%,呈典型的鋪路石樣改變。 2、EPCs的鑒定 細(xì)胞雙熒光染色鑒定結(jié)果：貼壁細(xì)胞呈Dil-ac-LDL(紅色熒光)、FITC-UEA-I(綠色熒光)雙陽性的即為EPCs,陽性率可達(dá)90%。 3、APOA1模擬肽對EPCs黏附、遷移功能的影響 與DMEM對照組相比,D-4F顯著增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附、遷移功能；R-D4F(5μg/ml,10μg/ml,50μg/ml)呈劑量依賴性的增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附、遷移功能。同時(shí),4h組黏附細(xì)胞數(shù)較2h組多,各項(xiàng)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與D-4F陽性對照組相比,同濃度(50μg/ml)的R-D4F比D-4F的促進(jìn)作用更強(qiáng),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 主要結(jié)論： 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)易于分離和體外培養(yǎng)擴(kuò)增,可作為治療血管損傷性疾病的種子細(xì)胞。載脂蛋白A1(APOA1)模擬肽R-D4F對EPCs的生物活性具有正向促進(jìn)作用,應(yīng)用于心腦血管疾病的治療具有一定的可行性。
[Abstract]:Aim: to explore the effect of apolipoprotein A1 mimic peptide R-D4F on adhesion and migration of endothelial progenitor cells. Methods: 1. (MNCs) was isolated from mononuclear cells and MNCS. was isolated from human umbilical vein blood by Ficoll-hypaque (dextran diatrizoate) density gradient centrifugation. Heavy suspension in EGM-2 complete medium, adjust cell concentration, and inoculate in the culture dish covered with human fibronectin. The culture dish was incubated in constant temperature incubator at 37 鈩，

本文編號：2374261