【摘要】：手足口病是嬰幼兒的常見疾病,病原體以新型腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)最為常見。近來世界各地大范圍手足口病的爆發(fā)性疫情主要由EV71引起。EV71屬小RNA病毒科、人腸道病毒屬成員。雖然EV71感染患者大多數(shù)癥狀輕微,但也有部分患者可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)性肺水腫和心肌炎等重癥癥狀。重癥患兒病情進(jìn)展快,易導(dǎo)致死亡。鑒于目前并沒有針對EV71感染的抗病毒藥物,只能對一般患者及重癥疑似病例進(jìn)行跟蹤,出現(xiàn)癥狀對癥治療。因此加強對EV71感染的基礎(chǔ)性研究,包括EV71復(fù)制的分子生物學(xué)特性、影響病毒復(fù)制的重要因素等顯得十分必要。盡管國內(nèi)外有關(guān)EV71的研究工作取得很大進(jìn)展,但深入了解EV71病毒復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍然十分迫切。 最近研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞編碼的microRNA(miRNA)分子與許多病毒復(fù)制關(guān)系密切。miRNA影響病毒的復(fù)制,一方面可通過影響與病毒復(fù)制密切相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞分子,如免疫應(yīng)答分子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等而調(diào)控病毒的復(fù)制進(jìn)程,另外還可能通過直接作用病毒mRNA,調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制。由于miRNA分子在轉(zhuǎn)錄后水平對基因調(diào)控具有普遍意義,并且細(xì)胞編碼的miRNA種類眾多,同一：niRNA可能有多個潛在靶點,同時單一基因可能受多個miRNA分子作用,形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此推測,EV71感染致病過程極有可能與miRNA分子發(fā)揮作用相關(guān)。所以,我們從miRNA對EV71感染后的變化為出發(fā)點,結(jié)合生物信息學(xué)分析,對可能影響EV71感染和復(fù)制的miRNA分子及其作用靶點進(jìn)行分析,試圖尋找影響EV71致病的關(guān)鍵因素。 在本研究中,我們從手足口病患兒糞便中分離了一株EV71病毒并進(jìn)行了全基因組測序分析。由于EV71病毒形成噬斑形狀不規(guī)則,難于鑒定。為了準(zhǔn)確檢測實驗中所用病毒的滴度,我們建立了優(yōu)于常用的蝕斑分析(Plaque assay)的MTT病毒滴度檢測法。然后,根據(jù)EV71病毒復(fù)制生長曲線,我們使用miRNA芯片檢測了EV71感染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)水平變化,發(fā)現(xiàn)了38個miRNA分子表達(dá)水平比在未感染細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)2倍以上,35個miRNA分子表達(dá)水平比在未感染細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào)2倍以上。通過生物信息學(xué)分析這些miRNA作用的靶基因,發(fā)現(xiàn)這些miRNA的靶點主要為細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因,初步探討了與EV71感染后細(xì)胞中異常表達(dá)的基因的關(guān)系。此外,我們利用miRNA數(shù)據(jù)庫和軟件分析可能直接作用于EV71-3'-UTR的miRNA分子,通過 種子序列匹配和結(jié)合自由能閾值設(shè)定,共找到了12個可能直接結(jié)合到EV71-3'-UTR區(qū)域從而影響EV71感染與復(fù)制的miRNA。 通過miRNA芯片篩選和軟件預(yù)測后,將這些可能影響EV71感染和復(fù)制的miRNA基因克隆入帶有報告基因的載體。我們共選取30個芯片篩選得到的miRNA和10個軟件預(yù)測得到的miRNA,構(gòu)建了可能影響EV71感染和復(fù)制的微型miRNA表達(dá)庫。之后,為了驗證miiRNA抑制EV71感染與復(fù)制的能力,我們選擇了報告基因表達(dá)水平較高的miRNA-3620表達(dá)載體進(jìn)行初步測試。將EV71-3'-UTR的報告基因GFP載體與miRNA-3620表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測miRNA-3620分子是否影響EV71的感染與復(fù)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

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本文編號：2347383