【摘要】：引言 人巨細胞病毒(HCMV)是一種229kb的雙鏈DNA染色體的皰疹病毒科病毒,HCMV感染是兒童常見的感染性疾病。由于HCMV產生的病毒因子逃逸宿主免疫,機體無法徹底清除病毒。目前研究表明,HCMV的復制和感染需要依賴其病毒的包膜糖蛋白,后者在識別宿主細胞膜受體、吸附和穿入宿主細胞、病毒的致病力以及誘導宿主反應等方面起重要作用。HCMV病毒感染細胞的過程是從病毒包膜糖蛋白與靶細胞膜表面受體結合開始的,結合后HCMV以膜融合或受體介導的內吞機制進入細胞。因此,阻遏HCMV糖蛋白與靶細胞膜的結合是控制HCMV感染的重要切入,點。 DC細胞表面的特異性細胞間黏附因子3結合非整合素分子(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN)是一種帶有外部甘露糖結合位點的C型凝集素結構域的Ⅱ型膜蛋白,能識別多種病原體如病毒、細菌、蠕蟲和真菌,在DC細胞識別模式中起重要作用。 天然免疫分子甘露(聚)糖結合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)系C型凝集素超家族成員之一,可與病毒表面多種糖基高效結合組成了機體抗病毒的第一道防線且參與感染進程的調控。目前未見將MBL應用于HCMV感染的研究報道。 本研究研制和純化重組MBL (rMBL),從人血漿中純化出天然MBL (hMBL),從人外周血單個核細胞中分離培養(yǎng)出高表達DC-SIGN的DC細胞(monocyte-derived dendritic cell, MD-DC);研究不同濃度的hMBL/rMBL在阻遏MD-DC捕獲HCMV,和阻遏HCMV在MD-DC間擴散的功能上的作用差異及時間點,并初步探討其機制。 方法 1、構建表達人野生型MBL的中國倉鼠卵巢細胞 構建含野生型MBL的pNOW/CMV-A表達載體,參照Ohtaniet al方法并加以改進。用上述載體轉染CHO細胞株,按Transfast說明書配制轉染試劑并進行轉染培養(yǎng)的CHO細胞,用G418篩選抗性細胞即穩(wěn)定轉染的細胞,熒光定量PCR分析穩(wěn)定轉染細胞株MBL基因的表達,用ELISA法檢測MBL蛋白濃度。 2、rMBL和hMBL的純化,定量和SDS-PAGE鑒定純度 CHO/MBL細胞在含20%小牛血清的MEDM培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取培養(yǎng)上清和人新鮮血漿進行甘露聚糖-Sepharose4B親和層析純化。SDS-PAGE鑒定純度,考馬斯亮藍進行蛋白定量。 3、MD-DC細胞的獲得 MD-DC是從人外周血濃縮單個核細胞(PBMC)分離培養(yǎng)而來,rhGM-CSF和rhIL-4刺激培養(yǎng),第3天半量更換含細胞因子的培養(yǎng)液,第6天收獲細胞。 4、MBL阻遏MD-DC細胞捕獲HCMV功能 取新收獲的,培養(yǎng)第6天的克隆增長的MD-DC,用不同濃度的hMBL/rMBL預處理DC細胞半小時后,再以HCMV感染MD-DC細胞2小時,熒光定量PCR檢測MD-DC內HCMV-DNA拷貝數(shù)。MD-DC捕獲HCMV-DNA拷貝數(shù)的百分數(shù)(%)=捕獲的HCMV-DNA拷貝數(shù)／初始加入的HCMV-DNA拷貝數(shù)×100。結果經SPSS軟件16.0統(tǒng)計學分析。流式細胞術檢測MD-DC內HCMV-PP65陽性率(PP65為HCMV的一種特異蛋白,2%為陽性,0.5%為陰性,0.5%-2%為可疑陽性)。用PKH26紅色熒光標記HCMV,用CD209-FITC綠色標記MD-DC細胞表面的DC-SIGN。通過激光共聚焦直接觀察DC-SIGN對HCMV的捕獲情況,用"imaginj"軟件定量分析單位細胞面積內的病毒量,結果經SPSS軟件16.0統(tǒng)計學分析。 5、MBL阻遏HCMV在MD-DC細胞間擴散 取新收獲的,培養(yǎng)第6天的克隆增長的ND-DC,經HCMV感染2小時后,將MD-DC和不同濃度的hMDL/rMBL共培養(yǎng)3天,在第24小時、第48小時,第72小時用經熒光定量PCR檢測MD-DC內HCMV-DNA拷貝數(shù)。MD-DC內HCMV-DNA拷貝數(shù)的百分數(shù)(%)=MD-DC內HCMV-DNA拷貝數(shù)／初始加入的HCMV-DNA拷貝數(shù)×100。結果經SPSS軟件16.0統(tǒng)計學分析。在第72小時用流式細胞術比較MD-DC內HCMV-PP65蛋白陽性率,明確MBL阻遏HCMV在MD-DC間擴散的功能。 結果： 1、穩(wěn)轉細胞目的基因表達效果檢測結果：RT-Q-PCR技術,檢測穩(wěn)轉細胞目的基因表達效果,篩選得到穩(wěn)定細胞株中,CHO-MBL目的基因表達是轉染空載體細胞株的103倍以上。 2、純化到大量的hMBL/rMBL:在800ml的CHO/MBL培養(yǎng)上清中,能純化到447.86ug rMBL；從200ml人血漿中純化出420.92ug hMBL。純化蛋白電泳：血漿MBL還原電泳可見26KD和32KD兩種單體、52KD二聚體、78KD三聚體；血漿MBL非還原電泳均為＞170KD之多聚體；重組MBL還原電泳,可見32KD單體；重組MBL非還原電泳：均為＞170KD之多聚體。 3.MD-DC的培養(yǎng)：人外周血單個核細胞經rhGM-CSF和rhIL-4刺激后,第6天收集MD-DC。光鏡下觀察MD-DC形態(tài)：可見細胞成簇懸浮生長,形態(tài)不規(guī)則,可見偽足。電鏡下MD-DC形態(tài)具有典型的樹突樣特征。用流式細胞儀檢測到表達DC的特征性標志：MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40.用抗DC-SIGN的單克隆抗體CD209-FITC流式細胞術檢測DC-SIGN百分數(shù)達88%。 4、不同濃度的hMBL/rMBL阻遏MD-DC捕獲HCMV的作用 熒光定量PCR法檢測MD-DC內HCMV-DNA的拷貝數(shù),經統(tǒng)計學分析,與對照組相比,1μg/ml的hMBL組和1μg/ml rMBL組均無顯著性差異,而5μg/ml和10μg/ml的hMBL組,5μg/ml和10μg/mlrMBL組均具有顯著性差異。各種濃度的hMBL組和rMBL組兩兩比較均值均偏低,但差異無統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測MD-DC內HCMV-PP65的陽性率,陰性對照組為陽性,10μg/ml濃度的hMBL/rMBL組均為可疑陽性。激光共聚焦技術下經定量檢測單位細胞面積內的病毒量,10μg/ml濃度的hMBL/rhMBL具有明顯的阻遏MD-DC捕獲HCMV的作用。 5、不同濃度的hMBL/rMBL阻遏HCMV在MD-DC間擴散的功能結果 經HCMV感染后的MD-DC和不同濃度的hMBL/rMBL共培養(yǎng)3天,結果經熒光定量PCR檢測,與對照組相比,在共培養(yǎng)的第24小時和第48小時各實驗組與對照組相比均無顯著差異。而在共培養(yǎng)第72小時檢測時,1μg/ml的hMBL/rMBL組和對照組相比,結果無顯著性差異。5μg/ml和10μg/ml的hMBL/rMBL組與對照組相比均有顯著性差異。各種濃度的hMBL組和rMBL組兩兩比較均值均偏低,但差異無統(tǒng)計學意義。在第72小時用流式細胞術比較細胞內HCMV PP65蛋白陽性率,10μg/ml的hMBL/rMBL孵育組也明顯低于對照組。 結論 1、成功建立分泌rMBL細胞株(CHO/rMBL),獲得大量高純度的rMBL和hMBL; 2、成功從人外周血單個核細胞分離培養(yǎng)出高表達DC-SIGN的MD-DC; 3、MD-DC具有捕獲HCMV的功能,HCMV能在MD-DC間擴散； 4、生理濃度的hMBL和rMBL能顯著阻遏MD-DC捕獲HCMV以及HCMV在MD-DC間的擴散,rMBL效果似較hMBL略差。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 段學章,王福生,王敏,莊輝,劉敬超,胡瑾華,李捍衛(wèi),張玲霞;乙型肝炎患者外周血Ⅱ型樹突狀細胞表型和功能鑒定及其意義的研究[J];中華醫(yī)學雜志;2003年07期

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本文編號：2343973