【摘要】：目的:建立誘導(dǎo)型衰老細(xì)胞模型并檢測(cè)抗衰老相關(guān)的Klotho基因啟動(dòng)子的不同截短型突變體的活性,為下一步研究奠定基礎(chǔ).方法:原代的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離鑒定后,通過(guò)設(shè)置不同過(guò)氧化氫的濃度,按時(shí)間梯度摸索誘導(dǎo)原代HUVEC細(xì)胞衰老的條件并最終通過(guò)SA-β-gal染色及定量PCR技術(shù)來(lái)確定其誘導(dǎo)條件.以全長(zhǎng)的Klotho啟動(dòng)子為模版,通過(guò)PCR的方法,獲得不同長(zhǎng)度的Klotho啟動(dòng)子截短型突變體,并通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同的啟動(dòng)子截短型突變體在誘導(dǎo)型衰老細(xì)胞內(nèi)的激活程度.結(jié)果:培養(yǎng)基中過(guò)氧化氫濃度為600μM,處理96 h后,成功構(gòu)建了誘導(dǎo)型衰老細(xì)胞模型;通過(guò)PCR的方法成功構(gòu)建了長(zhǎng)度分別為1 711 bp、1 262 bp、785 bp和735 bp的4個(gè)長(zhǎng)度截短型突變體,并發(fā)現(xiàn)735 bp的截短型突變體在誘導(dǎo)型衰老細(xì)胞內(nèi)的激活程度存在明顯差異.結(jié)論:成功建立了誘導(dǎo)型衰老細(xì)胞模型,并成功構(gòu)建了Klotho基因的啟動(dòng)子截短型突變體,檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)這些突變子在誘導(dǎo)型衰老細(xì)胞內(nèi)的激活程度存在明顯差異,為下一步治療衰老相關(guān)疾病奠定了良好的工作基礎(chǔ).
[Abstract]:Aim: to establish an induced senescence cell model and to detect the activity of different truncated mutants of anti-aging related Klotho gene promoters in order to lay a foundation for further research. Methods: the primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated and identified by flow cytometry. The conditions for inducing senescence of primary HUVEC cells were explored according to the time gradient, and the inducing conditions were determined by SA- 尾-gal staining and quantitative PCR technique. Using the full-length Klotho promoter as template, the truncated mutants of Klotho promoter with different lengths were obtained by PCR. The activation degree of different truncated promoter mutants in induction senescence cells was detected by double luciferase reporter gene system. Results: the induced senescence cell model was successfully established after 96 h treatment with the concentration of hydrogen peroxide 600 渭 m in the medium. Four truncated mutants with the lengths of 1 711 bp,1 262 bp,785 bp and 735 bp were successfully constructed by PCR, and the activation of 735 bp truncated mutants in induced senescence cells was found to be significantly different. Conclusion: the induced senescence cell model was successfully established, and the truncated mutants of Klotho gene promoter were successfully constructed. For the next step in the treatment of aging related diseases laid a good foundation for the work.
【作者單位】： 暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院暨南大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系基因工程藥物國(guó)家工程研究中心廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省生物技術(shù)藥物工程技術(shù)研究中心;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8147313) 廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016201604030039)
【分類號(hào)】：R339.38

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本文編號(hào)：2340590