【摘要】：【目的】研究MCMV感染對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 【方法】①體外細(xì)胞培養(yǎng)法傳毒增殖MCMV Smith毒株,Reed-Muench法計(jì)算病毒毒力。②建立乳鼠腦組織MCMV感染模型:ELISA法篩選MCMV IgM和IgG均為陰性的BALB/C小鼠,雌雄小鼠同籠受孕。仔鼠出生當(dāng)天,按窩隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組(n=90)顱內(nèi)接種MCMV病毒懸液10μl,對(duì)照組(n=90)顱內(nèi)接種等量的細(xì)胞維持液。無(wú)菌采集接種后3d、15d、30d腦組織各30只,應(yīng)用PCR法檢測(cè)其MCMV感染情況,實(shí)驗(yàn)組內(nèi)MCMV DNA陽(yáng)性以及對(duì)照組內(nèi)MCMV DNA陰性腦組織用于后續(xù)試驗(yàn)。③應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記SYP,并在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組乳鼠海馬SYP熒光顆粒數(shù)目,以此代表突觸數(shù)目。④應(yīng)用Real-time qPCR、免疫組織化學(xué)方法及Western blot法檢測(cè)各組乳鼠海馬突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 【結(jié)果】①M(fèi)CMV Smith毒株的TCID50為10-4.5/0.1ml。②實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中均可檢見MCMV DNA,對(duì)照組小鼠腦組織中未檢見MCMV DNA。③隨日齡增加,兩組乳鼠海馬SYP熒光顆粒數(shù)目不斷增加;與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相乳鼠海馬SYP熒光顆粒數(shù)目均減少,其中第15d和第30d減少更為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④隨日齡增加,兩組乳鼠海馬SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均不斷增高;與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低,其中,第15d和第30d下降更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)論】①M(fèi) CMV感染可導(dǎo)致發(fā)育中的乳鼠海馬突觸形成數(shù)目減少,并且隨著日齡的增加,其影響更為明顯。②MCMV可導(dǎo)致發(fā)育過程中的乳鼠突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降。 【目的】研究MCMV感染后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 【方法】①建立星形膠質(zhì)細(xì)胞MCMV感染模型:原代及傳代培養(yǎng)乳鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞;應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物GFAP的表達(dá)情況,鑒定并檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度;以100TCID50 MCMV攻擊星形膠質(zhì)細(xì)胞后,通過PCR檢測(cè)MCMV DNA、觀察細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒作用、CCK-8法檢測(cè)MCMV對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響,以及繪制MCMV在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)曲線等方法,判定星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MCMV的易感性、感染狀態(tài)以及MCMV在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)情況。②建立星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液(Astrocyte conditioned medium, ACM)與神經(jīng)元共培養(yǎng)體系:原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元;應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NSE的表達(dá)情況,鑒定并檢測(cè)神經(jīng)元的純度;以100TCID50 MCMV攻擊傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,收集MCMV感染后6、12、24、48、72h以及相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組ACM,過濾及離心后用紫外燈照射15min滅活CMV;應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同濃度ACM對(duì)神經(jīng)元存活的影響,以確定最佳的ACM濃度應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);根據(jù)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液各組分不同,分為實(shí)驗(yàn)組(含最佳濃度的各不同時(shí)間點(diǎn)感染ACM)、ACM對(duì)照組(含最佳濃度的各不同時(shí)間點(diǎn)正常ACM)及空白對(duì)照組(不含ACM)。③應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記SYP,并在熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元突觸數(shù)目,以此代表突觸數(shù)目。④應(yīng)用Real-time qPCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)各組神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 【結(jié)果】①體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞(純度達(dá)95%以上)感染MCMV后發(fā)生典型細(xì)胞病變;在MCMV感染48h的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到MCMV IE DNA的表達(dá);感染后3d~4d的ACM可使NIH 3T3細(xì)胞發(fā)生典型的CMV病毒蝕斑;星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染MCMV后24h開始死亡,感染后72h大部分細(xì)胞死亡,至感染后96h細(xì)胞幾乎全部死亡;MCMV在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制于感染后12h開始增高,72h達(dá)到高峰。②體外培養(yǎng)神經(jīng)元的純度可達(dá)98%以上,培養(yǎng)基含50%ACM時(shí)神經(jīng)元存活率最高。③與空白對(duì)照組相比,ACM對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組12h~72h SYP熒光顆粒數(shù)目均明顯增多(P0.01);與ACM對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組12h~72h SYP熒光顆粒數(shù)目均明顯減少(P0.01)。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),ACM對(duì)照組12h、24h、48h SYP熒光顆粒數(shù)目均比前一時(shí)相明顯升高(P0.01),72h變化不明顯(P0.05);實(shí)驗(yàn)組僅12h SYP熒光顆粒數(shù)比前一時(shí)相明顯升高(P0.01),24h、48h、72h變化不明顯(P0.05)。④與空白對(duì)照組比較,ACM對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組12~72h三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著升高(P0.01)。與ACM對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組12~72h三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低(P0.01)。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),ACM對(duì)照組12h、24h、48h三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均比前一時(shí)相明顯升高(P0.01),72h變化不明顯(P0.05);實(shí)驗(yàn)組僅12h三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均比前一時(shí)相明顯升高(P0.0.1),24h、48h、72h變化不明顯(P0.05)。 【結(jié)論】①M(fèi)CMV可在傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、產(chǎn)毒并產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)。②星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌物可促進(jìn)突觸形成,MCMV可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的合成及分泌功能而使突觸形成減少。③星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌物可促進(jìn)神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá),MCMV可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌功能而干擾神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)。 【目的】研究MCMV對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌TSP-1及TNF-α的影響。 【方法】傳代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入100 TCID50 MCMV及細(xì)胞維持液,對(duì)照組加入細(xì)胞維持液。收集6、12、24、48、72h的細(xì)胞和ACM,ACM過濾及離心后用紫外燈照射15min滅活CMV。①應(yīng)用Real-time qPCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)MCMV感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TSP-1、TNF-αmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。②應(yīng)用ELISA法檢測(cè)MCMV感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TSP-1及TNF-α的影響。 【結(jié)果】①與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相TSP-1及TNF-αmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低(P均0.01);感染時(shí)間越長(zhǎng),表達(dá)水平越低,差異越大。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),感染組12h~72h表達(dá)水平均低于前一時(shí)相(P均0.05)。②星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)12h后才能在ACM中檢測(cè)到TSP-1及TNF-α;對(duì)照組TSP-1及TNF-α含量在48h內(nèi)迅速升高(與前一時(shí)相比較,P均0.05),72h升高速度減慢;與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相TSP-1及TNF-α含量均減少(P均0.01),且12h~72h含量基本保持不變(與前一時(shí)相比較,P均0.05)。 【結(jié)論】①M(fèi)CMV感染后星形膠質(zhì)細(xì)胞TSP-1及TNF-αmRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)合成能力降低,且其降低程度隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而加劇,感染72h后幾乎無(wú)mRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)合成。②正常星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)TSP-1及TNF-α分泌量不斷增加,而MCMV感染抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的分泌功能,TSP-1及TNF-α分泌量始終維持在較低水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363
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本文編號(hào)：
2337323
