【摘要】：目的 在前期研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可以誘導小鼠黑色素瘤B16細胞凋亡,但是其是否能夠誘導B16細胞發(fā)生自體吞噬目前尚不明確。因此,在前期研究的基礎(chǔ)上,通過相差顯微鏡觀察細胞活性、透射電子顯微鏡(TEM)觀察細胞內(nèi)是否存在自體吞噬泡及其數(shù)量的變化,分析TNF-a是否能夠誘導B16細胞發(fā)生自體吞噬；進一步檢測自噬相關(guān)基因和蛋白的表達變化,分析參與TNF-α誘導的B16細胞自體吞噬的關(guān)鍵因子；并通過檢測自噬信號通路上的標志性基因和蛋白的表達,分析TNF-α誘導B16細胞自噬的信號通路,以及各通路對自噬的調(diào)控作用。 方法 1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細胞,根據(jù)處理方法不同分為對照組、TNF-α處理組(20ng/mlTNF-α處理12h、24h)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+TNF-α處理組(lOmmol/L3-MA預處理2h,20ng/mlTNF-α處理12h、24h)。 2.相差顯微鏡觀察TNF-α處理前后B16細胞的生長狀態(tài)和細胞活性。 3.TEM觀察TNF-a處理前后B16細胞內(nèi)自體吞噬泡的變化。 4.收取細胞,提取細胞總RNA,聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因Chop mRNA的表達變化。 5.收取細胞,RIPA裂解液裂解細胞,提取細胞總蛋白,蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測自噬標志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬性死亡標志性蛋白Beclinl、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路及磷酸肌醇3激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB,又稱Akt)通路關(guān)鍵蛋白核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)及Akt磷酸化水平的變化。 結(jié)果 1.與對照組相比,TNF-α處理后的B16細胞出現(xiàn)明顯的生長抑制現(xiàn)象,可見部分細胞死亡,TNF-α處理12h后細胞死亡量約10%,24h后死亡量達30%,具有明顯的時效關(guān)系。 2.與對照組相比,TNF-α處理后的B16細胞內(nèi),可見許多不同階段的自體吞噬泡。 3.與對照組相比,TNF-α處理12h的B16細胞中,自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ和自噬性死亡標志性蛋白Beclinl的表達顯著升高,24h較12h降低但仍高于對照組。3-MA+TNF-α處理組,12h時LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達水平較TNF-α處理組12h下降,24h較TNF-α處理組24h升高。 4.自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12mRNA在TNF-α處理12h、24h后表達水平均顯著升高；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因Chop mRNA表達顯著上調(diào),呈時問依賴性。 5.與對照組相比,TNF-α處理組中p70S6K磷酸化水平顯著下降,呈時間依賴性；Akt磷酸化水平顯著降低,24h較12h升高。3-MA+TNF-α處理組中,p70S6K磷酸化水平在12h較TNF-α處理組升高,24h較TNF-α處理組降低；Akt磷酸化水平較TNF-α處理24h稍低。 結(jié)論 1.TNF-α除了可以誘導B16細胞凋亡,還可以誘導B16細胞發(fā)生自體吞噬。 2.TNF-α誘導B16細胞的自噬作用達到一定水平后,自噬體的數(shù)量不再增加,自噬體的降解逐漸增多,從而導致自噬體數(shù)量下降。 3.TNF-α可以誘導B16細胞自噬性死亡。 4.TNF-α通過mTOR通路和PI3K/Akt通路誘導B16細胞自噬。 5.TNF-α可以導致B16細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導致細胞自噬。TNF-α是否可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致B16細胞自噬有待進一步研究。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2325190