【摘要】：炎癥反應是具有血管系統(tǒng)的活體組織對各種損傷因子的刺激所發(fā)生的一種防御機制,適當?shù)难装Y反應有利于激活免疫系統(tǒng)清除病原體,并可促進組織愈合；反應不足導致免疫缺陷,這可能引起感染和癌癥；反應過度會增加多種疾病的發(fā)病率和死亡率,如類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)性腸炎等。 脂多糖(1 ipopolysaccharide,LPS)作為革蘭陰性細菌的細胞壁成分,可以刺激巨噬細胞、內皮細胞等產生一系列致炎因子如腫瘤壞死因子-(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8等表達。大量實驗表明,在LPS所致的炎癥因子表達中,細胞內的一些信號通路如MAPK(mitogen-activated protein kinase)通路,NF-κB通路起重要作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物體內重要的信號轉導系統(tǒng)之一,參與介導細胞生長、分裂、分化、死亡以及細胞間的功能同步等多種生理過程。在細胞內以MAPKKK/MAPKK /MAPK為主干,再加上各種上游影響因子和下游作用底物,構成了一個功能多樣、反應靈敏的信號轉導網(wǎng)絡。這些與細胞信號相關的酶把細胞外信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞核,導致基因表達發(fā)生變化。而p38是MAPK通路中重要成員之一,與TNF-α、IL-1等致炎因子的誘生關系密切。研究發(fā)現(xiàn),NF-κB是LPS介導的信號轉導通路中最重要的下游通路,在多種炎癥介質的表達調控中均具有重要作用。NF-κB的激活涉及IKB(NF-κB抑制劑)的磷酸化,而后者有賴于IKK(IκB激酶)的調控,IKK/IκB/NF-κB是一個有機聯(lián)系的系統(tǒng),該信號通路在機體發(fā)揮重要作用[17-20]。 體液因素或細胞因子的自分泌和旁分泌影響抗炎或炎性介質釋放,神經(jīng)及其遞質也有直接調節(jié)作用。2000年,Nature雜志報道乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)與巨噬細胞上尼古丁受體結合能夠抑制內毒素誘導的炎性因子TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18等分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿的作用主要是通過與巨噬細胞上的α7煙堿型乙酰膽堿(α7-nAChR)受體結合,通過細胞內一系列的信號傳遞,最終抑制了Jak2-STAT3和NF-κB信號的激活,從而抑制了炎性因子的產生。由于乙酰膽堿是迷走神經(jīng)末梢分泌的主要神經(jīng)遞質,他們把這條通路命名為“膽堿能抗炎通路’'(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)。有研究表明α7-nAChR在該通路中起關鍵作用,它被激活后明顯抑制免疫細胞產生炎性因子如TNFα、IL-12、高遷移率族蛋白1 (high-mobility group box1,HMGB1)等,這些是α7nAChR介導抗炎作用的主要機制,與此同時它還可以促進轉化生長因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)、IL-10等抗炎因子的產生。因此,對α7nAChR的激動劑的研究可為新型抗炎藥物的開發(fā)提供可能性。本文所涉及的化合物GX-50則通過生物信息學計算發(fā)現(xiàn)一種潛在的α7nAChR激動劑,而N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺是將GX-50進行部分化學修飾所得,我們希望能通過相關實驗對這種化合物進行研究,為找到一種新型的抗炎藥物奠定基礎。 本研究的目的就是想探討N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺對于巨噬細胞Ana-1分泌細胞因子TNF-α和IL-1的影響,并進一步研究其作用機制。實驗首先用不同濃度的N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺處理巨噬細胞Ana-1,用MTT和LDH的方法進行藥物毒性檢測,篩選出對細胞無毒的1μM的N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺濃度用于后續(xù)實驗。接下來分別設計control(只加1640培養(yǎng)基)組,只加N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺組,先用1μM的N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺濃度預處理Ana-130分鐘,再加入LPS刺激4小時組,只加LPS處理4小時組共4組實驗。分別收集上清和細胞,提取蛋白質和RNA用于ELISA和PCR方法檢測各組TNF-α和IL-1的基因表達量,Western檢測IKK,IκB,p38的磷酸化蛋白量以及EMSA的方法檢測NF-κB的活化程度。最后用受體結合實驗檢測N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺與α7煙堿型乙酰膽堿受體的結合能力。 結果顯示,N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺對LPS刺激的巨噬細胞的細胞因子TNF-α分泌有顯著的抑制作用,其分泌量約比未經(jīng)化合物A預處理的分泌量的下降了50%左右,對IL-1分泌的抑制作用不明顯。在P38MAPK通路中和在NF-κB通路中,N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺預處理再用LPS處理組比只用LPS處理組p38和IKK、IκB的蛋白磷酸化程度分別下降了約29.8%,約27.7%和約58.8%。EMSA結果也表明,N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺預處理再用LPS刺激組比只用LPS刺激組NF-κB活化程度明顯下降。而α7nAChR受體特異性結合實驗也表明N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺可能是α7nAChR的潛在激動劑。 通過本次實驗證明了N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺對巨噬細胞分泌的炎性因子TNF-α有顯著抑制作用,其機制可能主要通過抑制了LPS刺激的P38MAPK和NF-κB信號通路活化起到抗炎作用。而N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺α7nAChR良好的結合,也暗示了膽堿能抗炎通路可能也參與其中,但是其深入機制還需要進行進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：2318770