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IQGAP1在肺炎衣原體感染誘導血管平滑肌細胞粘附和遷移中的作用

發(fā)布時間:2018-11-03 16:43
【摘要】:目的: 利用肺炎衣原體(Chlamdia pneumoniae, C.pn)體外感染大鼠血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)模型,分析C.pn感染對VSMC(?)細胞遷移相關(guān)基因表達的影響:觀察C.pn感染對VSMC粘附和遷移能力的影響;探討IQGAP1在C.pn感染誘導VSMC粘附和遷移中的作用。 方法: 1.C.pn增殖培養(yǎng)后體外感染大鼠VSMC; 2.應用基因芯片技術(shù)分析C.pn感染大鼠VSMC12h后,VSMC內(nèi)細胞遷移相關(guān)基因表達的改變; 3.運用MTT去觀察C.pn感染對VSMC粘附能力的影響; 4.應用Transwell實驗觀察C.pn感染對VSMC遷移能力的影響; 5.利用RT-PCR技術(shù)檢測C.pn感染的VSMC內(nèi)IQGAP1mRNA的表達水平; 6.采用Western blot技術(shù)檢測C.pn感染的VSMC為IQGAP1蛋白的表達水平; 7.應用RNA干擾技術(shù)使IQGAP1表達水平下調(diào),RT-PCR技術(shù)檢測IQGAP1mRNA的表達,以確定干擾效果; 8.運用MTT法觀察RNA干擾下調(diào)IQGAP1基因后對C.pn感染誘導的VSMC粘附的影響; 9.應用Transwell實驗觀察RNA干擾沉默IQGAP1表達后對C.pn感染誘導的VSMC遷移的影響。 結(jié)果: 1.C.pn感染組與正常對照組均應用Affymetrix Rat Genome2302.0Array,通過與大鼠31000個探針進行雜交,分析了31042個轉(zhuǎn)錄體和變異體,其中包括28000個己知基因。芯片雜交結(jié)果通過計算機掃描、定量和分析后,共發(fā)現(xiàn)差異表達基因35個,其中上調(diào)基因12個,下調(diào)基因23個;與細胞遷移密切相關(guān)的TLR2基因上調(diào)、TGF-B3和AKAP12基因下調(diào);虮倔w論分析結(jié)果顯示,35個差異顯著的基因中,30個基因可以在生物學過程、細胞組成和分子功能中找到注釋,4個基因未搜索到其功能分類;代謝通路分析結(jié)果顯示,7個基因參與細胞周期相關(guān)的信號通路、補體激活的經(jīng)典途徑相關(guān)信號通路、氧化應激相關(guān)信號通路和前列腺素合成調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路; 2.C.pn感染VSMC16h后,細胞粘附于Matrigel的能力明顯增強。MTT比色結(jié)果顯示,C.pn感染組的吸光度(Absorbance, A)值明顯高于正常對照組(P0.001);Cpn感染組的細胞粘附率為162.342%±4.691%(P0.001); 3.C.pn感染VSMC19h后,C.pn感染組的細胞遷移數(shù)目明顯多于正常對照組(P0.01);細胞遷移指數(shù)為152.653%±7.493%(P0.01); 4.C.pn感染VSMC2h后,IQGAP1(?)帶亮度與正常對照組差別不大;隨著感染時間延長,IQGAP1條帶亮度逐漸增強;C.pn感染12h時IQGAP1條帶亮度最強;之后,IQGAP1條帶亮度又逐漸減弱,直至感染48h時,條帶亮度與正常對照組基本相同; 5. Western blot結(jié)果顯示,C.pn感染VSMC后,隨著感染時間延長,IQGAP1的表達水平也整體表現(xiàn)出先逐漸升高而后又逐漸降低的趨勢;C.pn感染VSMC16h時IQGAP1的表達水平最高;隨后,IQGAP1的表達水平又逐漸降低; 6.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMC后24h,熒光顯微鏡下可觀察到pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1Scrambled shRNA轉(zhuǎn)染組(陰性對照組)和pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs轉(zhuǎn)染組細胞均發(fā)出清晰的綠色熒光,而無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組和正常對照組細胞中則未見有綠色熒光;轉(zhuǎn)染48h后,各組細胞中的綠色熒光較24h時增強;RT-PCR結(jié)果顯示,無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組和陰性對照組細胞內(nèi)IQGAP1mRNA表達水平與正常對照組無顯著差異;而IQGAP1mRNA在pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNA轉(zhuǎn)染組中的表達水平與正常對照組相比明顯降低: 7.經(jīng)MTT比色后發(fā)現(xiàn),pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs轉(zhuǎn)染組的A值明顯低于對照組(P0.001),細胞粘附率為68.543%±1.197%(P0.001);陰性對照組細胞粘附于Matrigel的能力與正常對照組相比無明顯變化(P0.05);C.pn感染轉(zhuǎn)染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs的VSMC后,該組的A值明顯低于C.pn感染組(P0.001),其細胞粘附率為104.991%±1.225%(P0.001); 8.重組質(zhì)粒pGPHl/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs轉(zhuǎn)染VSMC后,細胞遷移數(shù)目明顯低于正常對照組(P0.01),細胞遷移指數(shù)為69.927%±4.838%(P0.01);陰性對照組細胞的遷移數(shù)目與正常對照組相比無明顯差異(P0.05);C.pn感染轉(zhuǎn)染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs的VSMC后,該組細胞遷移數(shù)目明顯低于C.pn感染組(P0.01),細胞遷移指數(shù)為109.553%±4.401%(P0.01)。 結(jié)論: C.pn感染有可能通過上調(diào)TLR2基因并下調(diào)TGF-β3和AKAP12基因,促使VSMC遷移,進而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展;C.pn感染可促進VSMC粘附和遷移,其機制可能與其上調(diào)IQGAP1的表達水平,進而調(diào)控某些細胞遷移相關(guān)的信號通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:天津醫(yī)科大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2011
【分類號】:R363

【參考文獻】

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5 權(quán)偉;張利軍;陳寧;沈炳玲;葉靜;王蓓蓓;劉欣;張麗儥;;肺炎衣原體感染通過PI3K通路誘導血管內(nèi)皮細胞遷移[J];中國病理生理雜志;2010年07期



本文編號:2308350

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