【摘要】：一、背景 細菌、病毒、真菌和寄生蟲病原體以及這些病原體的代謝產(chǎn)物所引起的感染性疾病,迄今仍然是人類死亡和傷殘的主要原因之一,每年全球引起1700萬以上的新發(fā)病例。 尿路感染(Urinary tract infection, UTIs)是臨床感染中第二位的感染。女性因生理原因,較男性易感。大約有81%的UTIs發(fā)生在女性,年齡在16到35歲之間,30歲的婦女中有1/3-1/4都有過急性尿路感染的病史,并且復發(fā)率高。其次,UTIs也是免疫力低下人群常見的感染性疾病。尿路感染按解剖部位不同分為尿道下部感染和上行性感染,前者包括尿道炎和膀胱炎,后者指腎盂腎炎。腎盂腎炎是尿路感染最嚴重的形式,當病史超過半年至一年就有轉(zhuǎn)成慢性腎盂腎炎的可能性,而慢性腎盂腎炎久治不愈是腎功能衰竭較常見的原因之一。 尿路致病性大腸埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引起的UTIs占80%-90%大部分尿路致病菌都起源丁腸道,并經(jīng)尿道上行至膀胱,約95%的UTIs的起始感染部位是膀胱。目前主要的研究重點是圍繞UPEC與宿主之間的關(guān)系展開的。UPEC與其它致病性大腸埃希菌一樣,染色體上具有毒力因子信息。UPEC相關(guān)毒力因子包括：α-溶血素、細胞壞死因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白等；一方面,細菌通過這些毒力因子在宿主中達到存活繁殖的目的；另一方面宿主利用機體免疫系統(tǒng),防御來自細菌的攻擊,發(fā)生炎癥反應(yīng)；在不斷的相互作用過程中,細菌產(chǎn)生一些酶抵抗來自宿主的防御系統(tǒng)。比如,本次實驗中發(fā)現(xiàn)UPEC毒力因子ompT可水解人固有免疫成分人防御素,從而為細菌在宿主體內(nèi)存活提供條件。在尿路感染中,細胞因子是宿主免疫細胞產(chǎn)生的一大類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。本文以尿路感染動物模型為基礎(chǔ),擴展思路,測定宿主不同組織細胞因子的表達水平,為進一步深入尿路感染的機制提供依據(jù)。UPEC對宿主尿路上皮細胞的粘附能力是其致病的最重要因素,莢膜、脂多糖等一些粘附器官及粘附素的表達常常是致病的關(guān)鍵,其有助于UPEC結(jié)合于尿路進而避免被尿液沖刷清除。本次試驗研究表明：ompT基因的敲除,可能導致FimH基因表達的下調(diào)；FimH是一種已經(jīng)驗證的粘附素,并且前期體內(nèi)及體外結(jié)果也表明,ompT基因的敲除可使UPEC粘附率下降,與前期實驗結(jié)果一致。UPEC毒力因子的存在和毒力的大小決定了所致疾病的種類和嚴重程度；以相同方法,比較ompT對其他毒力基因的調(diào)控,也在本文中做了初步探討。這些毒力基因功能多與粘附、侵襲、血清抗性和代謝等相關(guān),并在實驗過程中證實。關(guān)于ompT調(diào)控這些毒力因子的相關(guān)機制還未得到實驗證實。 本研究利用前期RED同源重組系統(tǒng)構(gòu)建的尿路致病性大腸桿菌CFT073的ompT基因敲除株(CFT073ΔompT),并將ompT基因連接至低拷貝質(zhì)粒pUCT中構(gòu)建回補株(ompT/pUCT),考察ompT基因的缺失對致病株抵抗人防御素的影響。并通過參考文獻及蛋白功能預(yù)測得到,ompT通過調(diào)控某些毒力蛋白前體成分的表達而在尿路感染中起作用；并且通過熒光定量PCR驗證ompT基因劉‘主要毒力蛋白表達的影響。本課題的目的在于初步研究基因ompT在尿路致病性大腸桿菌的致病機理中所起到的作用。 二、研究方法 1、人防御素HBD-4克隆、表達以及鑒定 為進一步研究OmpT在尿路感染致病機理中所起的作用,克隆表達人β類防御素HBD-4模擬體外感染環(huán)境。本實驗以膀胱癌細胞總RNA為模板,PCR擴增HBD-4基因,連接至pET-28a,構(gòu)建表達載體pET28a-HBD-4。(?)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導后HBD-4表達。純化后恢復蛋白活性。通過SDS-PAGE檢測。 2、人防御素HBD-4抑菌活性檢測 將對數(shù)生長期的大腸埃希菌CFT073、CFT073△ompT和ompT/pUCT(CFU：1×106)40μl接種于的LB培養(yǎng)基中,再加入10μl防御素蛋白HBD-4孵育,使每管HBD-4蛋白的終濃度為200μg/ml。將培養(yǎng)物37℃孵育8h,間隔一小時在600nm處測定各管的吸光度。將各管稀釋106倍后均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,37℃孵育過夜后菌落計數(shù)。每種細菌均做副管。 3、尿路感染動物模型的建立 經(jīng)尿路分別灌注CFT073及CFT073△ompT,建立尿路感染小鼠動物模型,繼續(xù)飼喂12h,觀察小鼠活動情況。12h后處死小鼠,腹部消毒,取出膀胱；用PBS清洗5-10次；加入1ml PBS后勻漿,勻漿液作1：1000、1：10000、1：100000梯度稀釋。取出10μ1稀釋液均勻涂布于LB平板,12h后菌落計數(shù)。 4、尿路感染細胞因子的檢測 C57小鼠隨機分組,按尿路灌注方法分別接種野生株細菌、敲除株細菌以及回補株細菌,細菌接種完畢12h后分別取小鼠血液、腎臟及膀胱組織。血液樣本離心20rmin(2000-3000rpm/min),仔細收集上清；腎臟及膀胱組織分別加入1m1PBS緩沖液勻漿,離心,取上清。將上述樣品分別加入預(yù)制酶標包被板中,按試劑盒說明書操作,溫浴、洗滌、加酶、顯色后,終止反應(yīng)。置入酶標儀,以空白孔校正,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。繪制標準曲線,計算各組細胞因子水平。 5.ompT基因的調(diào)控作用 由于Ⅰ型菌毛中FimH為證實的粘附素,因此利用qPCR定量CFT073以及CFT073△ompT中fimH表達情況。CFT073以及CFT073ΔompT培養(yǎng)過夜,離心加TRIzol裂解,有機溶劑抽提總RNA,反轉(zhuǎn)錄；以16s-RNA為內(nèi)參基因,SYBR-Green染料法計算野生株與敲除株中fimH基因的表達量是否有差異。以相同方法分別計算兩種細菌中ompA、Hly、CNF1的表達的差異。 6、統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析利用SPSS13.0軟件,檢驗水準為a=0.05,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。防御素對CFT073、CFT073ΔompT及ompT/pUCT的抑菌作用采用單向方差分析(One-Way ANOVA);野生株及敲除株中fimH、ompA、Hly、CNF1的表達差異采用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T test)。 三、結(jié)果 1、HBD-4的表達 成功構(gòu)建表達載體pET28a-HBD-4,轉(zhuǎn)化入工程菌BL21中,成功表達純化并復性HBD-4。 2、防御素對CFT073、CFT073ΔompT及ompT/pUCT抑菌作用 經(jīng)稀釋106倍后菌落計數(shù)觀察,CFT073組有269±19個菌落形成單位,CFT073ΔompT組有5+4個菌落形成單位,ompT/pUCT組有232±19個菌落形成單位；各組方差齊,F=259.3,P0.001,按a=0.05水準,有統(tǒng)計學意義,認為三組間菌落形成單位總體均數(shù)不全相等,多重比較顯示,ompT敲除株菌落形成單位明顯少于野生株及回補株。 觀察生長曲線,防御素劉CFT073△ompT有較強的抑制,在波長600處OD值變化小。CFT073生長基本不受影響,ompT/pUCT雖然生長受到影響,但總體依然呈增殖狀態(tài)。 3、野生和敲除株細菌在小鼠體內(nèi)存活數(shù)的比較 通過小鼠膀胱灌注,以及菌落計數(shù)。經(jīng)多個獨立樣本非參數(shù)檢驗。分析結(jié)果顯示,X2=20.099,v=2,P0.001,三組間差異有顯著性意義。野生株小鼠體內(nèi)存活平均秩次為23.00,突變株為14.00,表明ompT基因敲除后細菌體內(nèi)存活數(shù)減少。 4、測定小鼠組織中細胞因子水平 尿路感染小鼠動物模型建模成功。ELISA法檢測細胞因子,在血漿中,三組細胞因子水平不同(F=12.268,P0.05)；兩兩比較后,敲除株與野生株不同,回補株與野生株不同,初步認為在血液中,三組細菌所致炎癥程度不同,野生株強于敲除株及回補株。在腎臟組織中,三組細菌因子水平不同(F=6.155,P0.05)；兩兩比較后,敲除株與野生株不同,回補株與野生株不同,初步認為在腎臟組織中,三組細菌所致炎癥程度不同,野生株強于敲除株及回補株。在膀胱組織中,三組細菌因子水平還不能認為不同,三組細菌所致炎癥程度相當。 5、omp T對毒力基因表達的調(diào)控 相對熒光定量顯示,野生株fimH基因表達量是敲除株的79倍。另外比較野生株和敲除株內(nèi)參基因16s-rRNA的光密度,t=-1.006,P0.05,野生株和敲除株光密度之間無差異,表明RNA提取無差異；所以,野生株fimH基因表達可能強于敲除株,ompT敲除可能下調(diào)了fimH基因的表達。相同方法擴增野生株和敲除株中ompA基因后,野生株ompA基因表達可能強于敲除株；ompT可能同樣影響基因ompA的表達。相同方法分析Hly基因,野生株Hly基因表達可能強于敲除株；表明ompT對基因Hly的表達有一定影響。相同方法分析CNF1基因,野生株CNF1基因表達可能強于敲除株；ompT可能影響基因CNF1的表達。 四結(jié)論 1、成功表達純化復性HBD-4后,ompT(?)敲除株較野生株及回補株對HBD-4更敏感；ompT可通過水解人防御素,有利于UPEC在尿路中存活。 2、在成功構(gòu)建小鼠尿路感染模型的基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)實驗表明,ompT基因的敲除可影響細菌體內(nèi)存活及體內(nèi)炎癥反應(yīng)。 3、熒光定量PCR表明,ompT基因的敲除下調(diào)了fimH的表達。表明ompT基因可能通過影響FimH的表達而在粘附中起作用。相同方法分析,ompT可能對ompA基因、hly基因及CNF1基因的表達也有影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 惠長野;郭妍;吳書馳;彭亮;曹虹;黃勝和;;大腸桿菌K1致病株外膜蛋白T體外功能[J];微生物學報;2010年01期

，

本文編號：2303147