【摘要】：樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是目前所知功能最強(qiáng)的、也是唯一能激活初始性T細(xì)胞(NT cell)的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell,APC),在免疫應(yīng)答中處于中心地位。臨床和研究中的DCs通常是人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)在細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4作用下體外誘導(dǎo)一周得到。但是有研究人員提出這種細(xì)胞因子來(lái)源的DCs缺乏功能的完整性,而模擬DCs在體內(nèi)的分化過(guò)程,在體外誘導(dǎo)DCs前體細(xì)胞向DCs的分化,對(duì)DCs功能的研究更具意義。 在體內(nèi)短期循環(huán)的單核細(xì)胞在炎癥或損傷信號(hào)的刺激下,穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入外周組織到達(dá)炎癥位點(diǎn),同時(shí)分化為DCs并進(jìn)一步成熟�；趦�(nèi)皮細(xì)胞提供的微環(huán)境在DC的發(fā)育中的重要作用,Randolph課題組最早提出了單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞穿越模型,PBMCs通過(guò)兩次穿越原代人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分化為APCs,該細(xì)胞在功能和表型上都與DCs相似。但是該方法操作復(fù)雜,使得其應(yīng)用受到極大的限制。而Schanen利用transwell技術(shù)將HUVECs與外周血單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),在PBMCs單向穿越HUVECs細(xì)胞層后成功獲得DCs,培養(yǎng)過(guò)程不需要加入外源細(xì)胞因子,分化時(shí)間僅為兩天。但是以上培養(yǎng)系統(tǒng)存在著較大的缺點(diǎn),即HUVECs是原代細(xì)胞,分離時(shí)操作繁瑣,在體外培養(yǎng)需要加入細(xì)胞因子,傳代次數(shù)較少,不適于長(zhǎng)期使用。 本研究提出了構(gòu)建分泌GM-CSF、IL-4的內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926來(lái)誘導(dǎo)PBMCs的分化。EA.hy926細(xì)胞是由HUVECs和人肺癌A549細(xì)胞融合得到,具有HUVEC的部分特征,可在不加入外源細(xì)胞因子的條件下在體外長(zhǎng)期傳代,遺傳背景單一,避免了原代細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)。通過(guò)慢病毒重組系統(tǒng)將GM-CSF、IL-4的基因重組進(jìn)入EA.hy926細(xì)胞的基因組中,達(dá)到提高兩個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)的目的,該細(xì)胞系將對(duì)DC的分化培養(yǎng)具有重要的意義。 本論文成功構(gòu)建了GM-CSF、IL4慢病毒共表達(dá)質(zhì)粒;包裝獲得的重組慢病毒可以高效的感染內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926,感染后的EA.hy926經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR、Western bloting及ELISA等多種方法進(jìn)行蛋白翻譯表達(dá)的鑒定,經(jīng)鑒定感染后細(xì)胞可以高效表達(dá)細(xì)胞因子GM-CSF、IL4,感染后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好,能夠長(zhǎng)期在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng),可以用于DC誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn);絲裂霉素C(MMC)可以抑制細(xì)胞增殖,而不改變細(xì)胞分泌蛋白的性質(zhì),是體外常用的制備飼養(yǎng)層的方法之一,我們通過(guò)實(shí)驗(yàn),最終確定了MMC的作用時(shí)間和濃度。采用免疫磁珠的方法從人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中分離得到了高純度的CD14+單核細(xì)胞,與建立的內(nèi)皮細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng),通過(guò)表型及形態(tài)分析,最后得出結(jié)論本實(shí)驗(yàn)室建立的內(nèi)皮細(xì)胞系可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為DCs,高表達(dá)T細(xì)胞共刺激分子和HLA-DR分子。本論文共分兩部分:(1)建立共表達(dá)GM-CSF、IL-4的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞系;(2)GM-CSF、IL-4-EA.hy926細(xì)胞作為飼養(yǎng)層與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)。主要研究結(jié)果如下: 一、建立共表達(dá)GM-CSF、IL-4的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞系利用重疊PCR將GM-CSF、IL4基因通過(guò)剪切體T2A序列相連,得到GM-CSF-T2A-IL4融合基因。將融合基因構(gòu)建入慢病毒表達(dá)載體pBPLV,得到重組的慢病毒表達(dá)載體。該重組慢病毒經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組慢病毒載體及慢病毒包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后經(jīng)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%以上;濃縮后的病毒可以有效的感染內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926細(xì)胞,感染后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)后感染效率依然可以達(dá)到94%,說(shuō)明目的基因可以在感染細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的傳代;感染后細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,其結(jié)果說(shuō)明,感染后細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)沒(méi)有減弱,能夠很好的進(jìn)行增殖;經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA方法證實(shí)感染后細(xì)胞hGM-CSF、hIL-4在mRNA水平的表達(dá)分別是未感染細(xì)胞的24倍和9946倍,在蛋白水平的表達(dá)分別是未感染細(xì)胞的145倍和23倍。 二、GM-CSF、IL-4-EA.hy926細(xì)胞作為飼養(yǎng)層與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)在絲裂霉素C(MMC)抑制內(nèi)皮細(xì)胞系生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中,確定了在處理時(shí)間為2.5h時(shí),MMC的濃度選擇為10μg/ml。在此濃度作用下,內(nèi)皮細(xì)胞系生長(zhǎng)受到抑制,但是保持其分泌的功能;利用磁珠分選CD14+單核細(xì)胞分選純度達(dá)到94%以上,與以構(gòu)建的內(nèi)皮細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng)后, CD14+單核細(xì)胞向DC方向分化,分化得到的DC表面有細(xì)小而密集的突起,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面的標(biāo)志,結(jié)果顯示此方法得到的DC表達(dá)CD1a,CD83,高表達(dá)DC特異性表面標(biāo)志DC-SIGN,高表達(dá)共刺激分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2281432