【摘要】：目的 通過比較慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,選擇較好的保存方法,為組織工程化關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)軟骨缺損的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 2-4周齡新西蘭大白兔,無菌條件下取其關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,進(jìn)行體外的原代培養(yǎng)。分別用慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法將所取的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行凍存,凍存時(shí)間為2周、1個(gè)月后取出部分凍存管,37℃水浴復(fù)溫后調(diào)定細(xì)胞濃度觀察,以新鮮軟骨細(xì)胞組作為對(duì)照組。對(duì)照組直接原代培養(yǎng)后檢測(cè)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)活力及其生物學(xué)特性。慢速連續(xù)降溫法是將細(xì)胞懸液和凍存液的混合液,分別裝入凍存管,放入程控冰箱,以1℃/min的速度連續(xù)降溫至-80℃后,迅速放入液氮中保存的方法。慢速梯度降溫法是將細(xì)胞懸液和凍存液的混合液在降至-80℃之前,分4個(gè)梯度降溫的保存方法。玻璃化凍存法是將細(xì)胞懸液和玻璃化凍存液混合后,以最快的速度直接投入液氮中保存的方法。不同凍存方法的細(xì)胞于凍存2周、1個(gè)月時(shí)取出,行甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞表型、CCK8法繪制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、Western blot方法檢測(cè)II型膠原表達(dá),RT-PCR檢測(cè)II型膠原mRNA的表達(dá)情況。以新鮮軟骨細(xì)胞組作為對(duì)照組,比較各實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞的不同保存情況。 結(jié)果 1.軟骨細(xì)胞的形態(tài)觀察以及生長(zhǎng)情況在顯微鏡下觀察:分離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形,呈懸浮狀態(tài),接種24h后大部分細(xì)胞開始沉降于培養(yǎng)瓶壁上,36h后貼壁率可達(dá)90%左右。貼壁后,細(xì)胞逐漸展開、變平、伸出短小的突出,外觀呈多角形、不規(guī)則形。細(xì)胞胞質(zhì)豐富,胞核清楚,核圓形或橢圓形,位于胞體中心,核仁為1-3個(gè),具有折光性。約7d左右匯合成單層鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿底面。傳代后生長(zhǎng)速度加快,約5d左右即可傳代,細(xì)胞周圍可見具有折光性的細(xì)胞外基質(zhì),細(xì)胞長(zhǎng)成一片可呈明顯的“鋪路石”狀外觀。凍存2周復(fù)蘇后,慢速梯度降溫冷凍法的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)較接近于新鮮軟骨細(xì)胞。慢速連續(xù)降溫組和玻璃化組,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形,細(xì)胞數(shù)目少。凍存1個(gè)月時(shí),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)均較對(duì)照組有明顯區(qū)別,細(xì)胞胞質(zhì)減少,胞核不清晰。甲苯胺藍(lán)染色顯示,新鮮軟骨細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞爬片后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色后鏡下觀察,軟骨細(xì)胞染成藍(lán)紫色,有核仁1-2個(gè),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞明顯可見多數(shù)細(xì)胞有絲分裂相,細(xì)胞胞漿內(nèi)見藍(lán)紫色異染顆粒,細(xì)胞外基質(zhì)染成淺藍(lán)色,集落樣生長(zhǎng)區(qū)中心濃染成紫紅色。隨著細(xì)胞傳代,染色逐漸變淺變淡。凍存2周、1個(gè)月時(shí),各實(shí)驗(yàn)組于胞漿中仍可見藍(lán)紫色異染顆粒,說明經(jīng)傳代以及凍存后,各組細(xì)胞仍保持軟骨細(xì)胞表型。 2.軟骨細(xì)胞活性的變化新鮮軟骨細(xì)胞組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線成對(duì)數(shù)型,保存2周、1個(gè)月時(shí),各實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組比較,細(xì)胞活性均較新鮮細(xì)胞組差。不同實(shí)驗(yàn)組在凍存2周、1個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)上,細(xì)胞生長(zhǎng)活力凍存2周的生長(zhǎng)情況要好于凍存1個(gè)月的細(xì)胞且差異明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。凍存2周時(shí),慢速梯度降溫冷凍法組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于慢速連續(xù)降溫法和玻璃化凍存法,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。凍存1個(gè)月時(shí),慢速梯度降溫冷凍法組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于慢速連續(xù)降溫法和玻璃化凍存法,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。不同凍存方法對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響不同且隨凍存時(shí)間的變化對(duì)軟骨細(xì)胞存活和率的影響也不同。隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng),曲線的峰值出現(xiàn)的時(shí)間推后并且峰值降低。 3.軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性II型膠原表達(dá)凍存2周時(shí),慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法的II型膠原表達(dá)均減少與新鮮軟骨細(xì)胞組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法的II型膠原表達(dá)兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。凍存1個(gè)月時(shí),慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法的II型膠原表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法、慢速連續(xù)降溫法,凍存2周、1個(gè)月組內(nèi)兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 4.軟骨細(xì)胞II型膠原mRNA的表達(dá)四組的mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物中都能看到預(yù)期長(zhǎng)度的II型膠原特異性條帶。新鮮軟骨細(xì)胞組II型膠原mRNA表達(dá)最強(qiáng),與其它各組相比均有顯著差異。凍存2周時(shí),三種的凍存方法中,慢速梯度降溫冷凍法組對(duì)II型膠原mRNA表達(dá)減少最弱,與慢速連續(xù)降溫法比較有顯著差異,與玻璃化凍存方法比較有顯著差異;慢速連續(xù)降溫法與玻璃化凍存方法比較無顯著差異。凍存1個(gè)月時(shí),慢速梯度降溫冷凍法組的mRNA表達(dá)明顯高于慢速連續(xù)降溫法組和玻璃化凍存方法組,但低于慢速梯度降溫冷凍法組凍存2周時(shí)mRNA表達(dá)。 結(jié)論 1.慢速梯度降溫冷凍法對(duì)軟骨細(xì)胞活性及其生物學(xué)特性的影響較小,有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。 2.慢速梯度降溫冷凍法、玻璃化凍存法、慢速連續(xù)降溫冷凍法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響均具有時(shí)間依從性,隨著時(shí)間的推移,軟骨細(xì)胞生物活性逐漸下降。 意義 雖然治療各種關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法非常多,但均不能達(dá)到理想的修復(fù)效果,不能恢復(fù)其原有的生物力學(xué)性能。組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的構(gòu)建,為上述問題提供了更好的解決辦法。而構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨需要大量的種子細(xì)胞,同種異體軟骨細(xì)胞是種子細(xì)胞的一個(gè)重要來源但數(shù)量有限,且受到法律和倫理道德方面的約束,因此如何長(zhǎng)期保存并大量應(yīng)用目前并沒有成熟的方法。本實(shí)驗(yàn)通過比較目前常見的幾種凍存方法,篩選出較好的凍存方法保存種子細(xì)胞,為構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2275766