【摘要】：疲勞一直以來都是一個讓我們熟悉的話題,目前,我們對于疲勞的理解也已經(jīng)從單純的軀體疲勞擴展到精神和認知的功能失調(diào)。疲勞作為一種非特異的癥狀不僅存在于許多疾病中(比如多發(fā)性硬化,腫瘤,腦卒中,系統(tǒng)性紅斑狼瘡,缺血性心臟病,重型抑郁等等),并且也可以作為一個獨立癥狀存在于普通人群中,尤其是在受過高等教育的中高級白領(lǐng)人群中更為普遍。在疲勞的狀態(tài)下,人們的免疫力被嚴重削弱,從而容易罹患各種感染性疾病;同時疲勞也會增加人們患心血管疾病的風(fēng)險,比如誘發(fā)急性心肌梗塞。因此如果能有效地緩解疲勞將會對改善我們的工作和生活的質(zhì)量有著極為顯著的意義。 在本研究中,我們運用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在疲勞大鼠模型中篩選到一個疲勞相關(guān)蛋白:Orosomucoid 1 (ORM 1),通過在體外合成該蛋白的純品以及siRNA序列進行整體實驗發(fā)現(xiàn)該蛋白具有抗疲勞活性,而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素由于能有效地誘導(dǎo)該蛋白的體內(nèi)合成也具有抗疲勞活性。另外,對紅霉素進行結(jié)構(gòu)改造獲得的螺縮酮經(jīng)證實已無抗菌活性,但仍能誘導(dǎo)ORM 1的表達,延長小鼠的游泳時間,從而也具有抗疲勞活性。隨后的機制研究發(fā)現(xiàn)ORM 1可以通過增加p-AMPK的表達來刺激GLUT4的膜轉(zhuǎn)位,從而動員更多的葡萄糖被轉(zhuǎn)運至肌細胞內(nèi)來刺激糖原合酶的表達使得機體骨骼肌中的糖原儲備增加,最終增強機體的抗疲勞能力。另外,我們收集了100例普通人群和46例慢性疲勞綜合癥病人的血樣檢測ORM 1的含量,發(fā)現(xiàn)疲勞狀態(tài)超過半年的人群(包括慢性疲勞患者,特發(fā)性慢性疲勞患者和慢性疲勞綜合癥患者)血樣中的ORM 1均顯著增加。另外,我們還發(fā)現(xiàn)雌性大鼠比雄性大鼠更易疲勞可能與雌激素抑制ORM 1的產(chǎn)生有關(guān)。 具體實驗結(jié)果如下: 實驗一:疲勞大鼠肝臟組織差異表達蛋白的尋找以及驗證 利用DIGE實驗技術(shù)平臺,比較分析疲勞大鼠和正常大鼠肝臟差異蛋白的表達。結(jié)果有11個差異蛋白點得到串聯(lián)質(zhì)譜的鑒定。其中,alpha-酸性糖蛋白(alpha-1 acid glycoprotein,ORM 1)在疲勞大鼠肝臟中顯著增加。這一結(jié)果在隨后的Western Blot實驗得到驗證。 實驗二:ORM 1與疲勞的關(guān)系 為了進一步研究血清ORM 1的含量與疲勞之間的關(guān)系,我們引入了運動力竭疲勞模型(簡稱為力竭組)和經(jīng)典疲勞模型(疲勞組),檢測了兩組肝臟,骨骼肌和血清中ORM 1的表達。發(fā)現(xiàn)在疲勞組大鼠中,其肝臟,血清和骨骼肌中的ORM 1的水平都顯著增加,而在力竭組大鼠中只有血清和肌肉中的ORM 1含量增加。此外,為了明確疲勞的嚴重程度與血清ORM 1的含量之間的聯(lián)系,我們檢測了經(jīng)典疲勞模型大鼠在疲勞1天,3天,5天,疲勞5天后加休息1天和疲勞后5天加休息3天的血清ORM 1含量,發(fā)現(xiàn)隨著疲勞程度的逐漸加重,其血清中ORM 1的水平亦相應(yīng)增高,而當疲勞大鼠經(jīng)過休息恢復(fù)以后,其血清中ORM 1的含量亦逐漸回復(fù)到正常水平。 實驗三:ORM 1在疲勞中的功能研究 為了進一步明確ORM 1在疲勞中所發(fā)揮的作用究竟是具有某種生物學(xué)功能還是僅僅只是一個標志物,我們通過給C57小鼠注射純品ORM 1,發(fā)現(xiàn)小鼠游泳時間顯著延長。與此同時,當疲勞的小鼠不能正常產(chǎn)生ORM 1(siRNA in-vivo)時會表現(xiàn)得更易疲勞(與單純疲勞的小鼠相比,其游泳時間顯著縮短。) 實驗四:大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過誘導(dǎo)ORM 1的表達發(fā)揮抗疲勞活性 依據(jù)文獻報導(dǎo),選用不同劑量的紅霉素來誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)ORM 1的表達并同時檢測其相應(yīng)的游泳時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn),紅霉素可以劑量依賴性地上調(diào)小鼠血清ORM 1的水平,同時劑量依賴性地延長小鼠的游泳時間。在對紅霉素治療小鼠的同時干擾ORM 1的合成后,紅霉素延長小鼠游泳時間的效應(yīng)則被大大抵消。大環(huán)內(nèi)酯類的其他抗生素例如克拉霉素和阿奇霉素也具有相類似的效果。另外,在對紅霉素進行結(jié)構(gòu)修飾后發(fā)現(xiàn),其抗菌活性基團對于其發(fā)揮抗疲勞效應(yīng)不是必須的。 實驗五:ORM 1抗疲勞的機制研究 ORM 1可以上調(diào)骨骼肌p-AMPK的表達,促進葡萄糖轉(zhuǎn)運子4(Glucose Transporter 4, GLUT4)從細胞漿轉(zhuǎn)運到細胞膜來發(fā)揮葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)移,最終通過活化糖原合酶來增加細胞中的糖原儲備。在疲勞組和紅霉素組中,ORM 1刺激GLUT 4從胞漿轉(zhuǎn)位到胞膜(膜GLUT 4的表達增加),使得糖原合酶的活性形式非磷酸化的糖原合酶表達增加,從而使得糖原的合成相應(yīng)增加。這一效應(yīng)在AMPK-α敲除的小鼠中消失,盡管紅霉素依舊能誘導(dǎo)ORM 1的表達增加,但是后續(xù)的GLUT 4轉(zhuǎn)位以及最終的糖原儲備增加效應(yīng)已經(jīng)被明顯削弱。 實驗六ORM 1在人群中的研究 我們在人群中通過發(fā)放疲勞問卷的方式來對人群的疲勞程度進行分級:對照,輕度疲勞,疲勞,慢性疲勞,特發(fā)性慢性疲勞和慢性疲勞綜合癥(排序從輕到重)。在所選取的100例人群中,有38例被納入不疲勞組,22例納入輕度疲勞組,18例納入疲勞組,9例納入慢性疲勞組,13例納入特發(fā)性慢性疲勞組(其中有7例血清ORM 1含量高于人群的ORM 1參考值上限:1 mg/ml)。沒有個體符合慢性疲勞綜合癥的診斷。隨后我們檢測了上述所有個體的血清ORM 1的含量,發(fā)現(xiàn)在疲勞狀態(tài)超過半年以上的慢性疲勞組和特發(fā)性慢性疲勞組中其血清ORM 1的水平要顯著性地高于對照組。另外,對納入研究的慢性疲勞綜合癥的46例患者進行血清ORM 1檢測,亦同樣發(fā)現(xiàn)ORM 1顯著性地升高。 實驗七:疲勞的性別差異與雌激素抑制ORM 1的產(chǎn)生有關(guān) 我們發(fā)現(xiàn)雌性大鼠的游泳時間要顯著少于雄性大鼠。而去卵巢的雌性大鼠的游泳時間要顯著性地長于假手術(shù)組,在對去卵巢大鼠給予雌激素治療以后,其游泳時間與假手術(shù)大鼠組沒有差異。隨后我們檢測了雌雄大鼠在疲勞狀態(tài)下肝臟ORM 1的含量,發(fā)現(xiàn)在同樣的疲勞狀態(tài)下,雌性大鼠所產(chǎn)生的ORM 1要顯著性地少于雄性大鼠。在對去卵巢大鼠和假手術(shù)組的大鼠肝臟ORM 1的含量進行檢測時,發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠肝臟能產(chǎn)生更多的ORM 1。隨后我們分別測定了雌激素受體α和β敲除的小鼠的游泳時間,發(fā)現(xiàn)同野生型相比,在雌激素受體被敲除以后其游泳時間的性別差異消失。提示我們疲勞的性別差異可能與雌激素抑制ORM 1的產(chǎn)生有關(guān)。 結(jié)論: 1. ORM 1是一種內(nèi)源性的抗疲勞蛋白; 2. ORM 1可能作為慢性疲勞綜合癥的診斷標志物; 3.疲勞的性別差異可能與疲勞時雌激素對ORM 1的產(chǎn)生抑制有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【引證文獻】

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1 王倩;劉淑集;吳成業(yè);;糖蛋白的制備、結(jié)構(gòu)分析及生理功能研究現(xiàn)狀[J];福建水產(chǎn);2012年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬燦;自體骨髓源神經(jīng)干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號：2262178