【摘要】：白念珠菌依然是造成免疫功能低下病人感染的最主要的致病性真菌,臨床上由于唑類藥物尤其是氟康唑的長期應用,引起白念珠菌耐藥日趨嚴重,使得臨床白念珠菌感染的治療更加困難和復雜。白念珠菌耐藥性的形成是由多因素造成,已有研究發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路參與了白念珠菌耐藥性的形成,是白念珠菌的致病因子之一。本實驗室前期利用基因修飾技術(shù)在體外證明RTA2基因是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路調(diào)節(jié)白念珠菌對唑類藥物的耐藥性產(chǎn)生的必需基因,但并未從體內(nèi)證實RTA2基因是否與白念珠菌耐藥性形成有關(guān)。因此本課題在實驗室構(gòu)建菌株及臨床菌株中,對于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路及RTA2基因與白念珠菌耐藥性形成的關(guān)系及作用在體內(nèi)外進行深入研究。 為進一步研究與證實鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路在白念珠菌耐藥性中形成的作用,本課題選取來自不同地域、不同病患的45株臨床白念珠菌,利用微量液基稀釋法的體外藥敏實驗,外源性給予人血清內(nèi)類似濃度的離子鈣激活鈣信號通路,考察菌株對氟康唑敏感性的變化,發(fā)現(xiàn)45株臨床菌中37.8%的菌株由敏感變?yōu)閯┝恳蕾囆阅退?13.3%的菌株由敏感變?yōu)槟退?從體外間接證實鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的激活,降低了菌株對藥物的敏感性,參與了菌株耐藥性的形成。另一方面,在血清內(nèi)類似濃度的離子鈣環(huán)境下,臨床白念珠菌對藥物的敏感性的降低有可能意味著臨床治療過程中,菌株對氟康唑的實際敏感性與體外測定的敏感性不一致的情況發(fā)生。而采用同濃度鈣離子激活該通路后,利用real time RT-PCR法測定RTA2基因表達水平的變化,66.7%的菌株RTA2表達上調(diào),證明大部分菌株中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的激活促使了RTA2基因的表達上調(diào)。 為分析同濃度離子鈣條件下,體內(nèi)外白念珠菌對藥物的敏感性是否一致,鈣調(diào)通路及RTA2基因?qū)甓玖Φ挠绊懠澳退幮孕纬芍械淖饔?我們將體外MIC值及RTA2表達水平兩指標進行分類,共選取8株臨床白念珠菌及前期構(gòu)建的RTA2基因缺失菌、轉(zhuǎn)錄因子編碼基因CRZ1基因缺失菌、回復菌及野生菌進行小鼠體內(nèi)毒力及藥物治療效果評價,考察小鼠生存率,腎菌落數(shù)并進行病理切片分析,發(fā)現(xiàn)體外加鈣后測定MIC值變化小、未耐藥菌株感染小鼠后,經(jīng)氟康唑治療效果優(yōu)于MIC值變化大、產(chǎn)生耐藥及RTA2表達上調(diào)的菌株;而RTA2基因缺失菌及CRZ1基因缺失菌系統(tǒng)性真菌感染造模后,經(jīng)氟康唑治療效果也優(yōu)于基因回復菌及野生菌。但各組菌株感染小鼠后未經(jīng)治療,生存時間及腎菌落數(shù)沒有差異。以上結(jié)果表明RTA2基因與菌株的毒力無關(guān),但是與菌株體內(nèi)對氟康唑藥物敏感性相關(guān),并且以依賴鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的方式參與了白念珠菌耐藥性的形成。 為探究鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路激活后,小部分臨床菌株RTA2基因表達水平?jīng)]有變化的原因,本課題首先對部分菌株的RTA2基因上游啟動區(qū)1500bp序列進行測序,發(fā)現(xiàn)六個位點的堿基突變,繼而采用報告基因法,將含有不同突變位點不同長度片段與報告基因質(zhì)粒pBES116-rluc-act1連接,轉(zhuǎn)化入RTA2缺失菌JXM101中,菌株提蛋白后加入熒光素酶底物,通過測定發(fā)光值確定熒光素酶基因的表達,來驗證啟動區(qū)不同突變位點是否有意義。我們發(fā)現(xiàn),含-531bp、-652bp堿基突變的兩菌株未測出熒光素酶活性,推測兩位點的堿基突變導致鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的轉(zhuǎn)錄因子Crz1p不能正常識別啟動區(qū),影響了RTA2基因的表達。 綜上所述,本課題在體內(nèi)外共同驗證了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路及其靶基因RTA2在白念珠菌耐藥性的形成中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Candida albicans is still the most important pathogenic fungi causing infection in immunocompromised patients. The long-term use of azoles, especially fluconazole, has led to increasingly serious drug resistance of Candida albicans, making the treatment of clinical Candida albicans infection more difficult and complex. Previous studies have shown that the calcineurin pathway is involved in the formation of drug resistance in Candida albicans and is one of the pathogenic factors of Candida albicans.In our laboratory, gene modification technique was used to prove that RTA2 is an essential gene for calcineurin pathway to regulate the resistance of Candida albicans to azole drugs in vitro. Therefore, the relationship between calcineurin pathway, RTA2 gene and the formation of drug resistance of Candida albicans and its role in vitro and in vivo were studied in this study.
In order to further study and confirm the role of calcineurin pathway in the formation of drug resistance in Candida albicans, 45 clinical Candida albicans strains from different regions and different patients were selected in this study. Microdilution in vitro drug sensitivity test was used to investigate the calcium-activated signaling pathway of exogenous calcium ions with similar concentration in human serum. The changes of susceptibility to fluconazole showed that 37.8% of the 45 clinical strains changed from susceptibility to dose-dependent drug resistance, 13.3% from susceptibility to drug resistance, indirectly confirmed the activation of calcineurin pathway in vitro, reduced the sensitivity of the strains to drugs, and participated in the formation of drug resistance. The decrease of susceptibility of clinical Candida albicans to fluconazole in the presence of intracellular calcium may mean that the actual susceptibility to fluconazole is inconsistent with the in vitro susceptibility during clinical treatment. The expression level of RTA2 was up-regulated in 66.7% of the strains, indicating that the activation of calcineurin pathway in most strains promoted the up-regulation of RTA2 gene expression.
In order to analyze the susceptibility of Candida albicans in vitro and in vivo to the same concentration of ionic calcium, the effects of calcium regulation pathway and RTA2 gene on the virulence of Candida albicans and the formation of drug resistance, we classified the MIC value and RTA2 expression level in vitro and selected 8 clinical Candida albicans and the deletion of RTA2 gene constructed earlier. The toxicity of CRZ1 gene deleted bacteria, recombinant bacteria and wild bacteria in vivo and the effect of drug treatment in mice were evaluated. The survival rate of mice, the number of colonies in kidney and the pathological section were observed. It was found that the MIC value changed little after calcium was added in vitro. After infection with non-resistant bacteria, the therapeutic effect of fluconazole was better than that of MIC value. The results showed that there was no difference in the survival time and the number of colonies in the kidney between RTA2 gene deleted strains and CRZ1 gene deleted strains. The virulence of the strain was not related to the susceptibility of the strain to fluconazole, but was related to the susceptibility of the strain to fluconazole.
To explore the reason why the expression level of RTA2 gene in a small number of clinical strains did not change after activation of calcineurin pathway, we first sequenced the 1500bp sequence of the upstream promoter region of RTA2 gene in some strains, and found six mutation sites. Then we used the reporter gene method to find the different length slices containing different mutation sites. Segment was linked to reporter gene plasmid pBES116-rluc-act1 and transformed into RTA2-deficient strain JXM101. The luciferase substrate was added after protein extraction. Luciferase gene expression was determined by luminescence value to verify the significance of different mutation sites in the promoter region. It is speculated that the two-point mutation of the base leads to the inability of the transcription factor Crz1p in the calcineurin pathway to recognize the promoter region and affects the expression of RTA2 gene.
In conclusion, this study demonstrated that calcineurin pathway and its target gene RTA2 play an important role in the formation of drug resistance in Candida albicans in vitro and in vivo.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R379

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本文編號：2225353