發(fā)布時(shí)間：2018-08-22 10:14

【摘要】：目的探討分離及培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的最佳條件。方法選取不同周齡(2、3、4、8 w)的SD大鼠;采用全骨髓貼壁篩選法對不同的培養(yǎng)基(L-DMEM、DMEM/F12),血清體積分?jǐn)?shù)(7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%),首次換液時(shí)間(48、72、96 h),換液方法(全換液、半換液)分組進(jìn)行培養(yǎng),每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目的變化,細(xì)胞融合80%~90%時(shí)進(jìn)行消化計(jì)數(shù),記錄達(dá)到傳代要求的時(shí)間,取第三代細(xì)胞繪制BMSCs生長曲線,各組間免疫熒光檢測CD34、CD44的表達(dá)率。結(jié)果 1第2~3周SD大鼠達(dá)到傳代要求時(shí)BMSCs數(shù)目最多、所需時(shí)間最短,第8周BMSCs含量明顯減少,難以形成集落生長,細(xì)胞融合不到50%;DMEM/F12培養(yǎng)基中的細(xì)胞貼壁早、活性強(qiáng),L-DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長緩慢,兩組相比差異顯著(P0.05);72 h全換液和48 h半換液組細(xì)胞數(shù)目多,二者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),24 h全換液細(xì)胞數(shù)目少,72h半換液雜細(xì)胞多,細(xì)胞呈全分布,二者增值速度慢,與前者相比差異顯著(P0.05);體積分?jǐn)?shù)越高細(xì)胞生長分化越快,時(shí)間越短,但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),傳代培養(yǎng)中高體積分?jǐn)?shù)的細(xì)胞易老化。2接種圓形BMSC培養(yǎng)6 h后貼壁,分化成圓形、類圓形或多角形;72 h后有少量短梭形、星形細(xì)胞分散、貼壁生長,部分細(xì)胞伸出一支或多支偽足,類似于成纖維細(xì)胞;約6 d后BMSCs細(xì)胞集落呈放射狀排列,伸出長短及粗細(xì)均不規(guī)則,伴形態(tài)各異的偽足、細(xì)胞胞核大、核仁清晰;約10 d細(xì)胞能融合80%~90%培養(yǎng)面;傳代后24 h內(nèi)可見細(xì)胞已完全貼壁,3 d可見以梭形為主的細(xì)胞鋪滿80%~90%培養(yǎng)面;經(jīng)過1~2次傳代后,細(xì)胞呈放射狀或平行排列,形態(tài)趨于一致。3傳代2 d后,細(xì)胞緩慢生長,處于生長停滯期;3 d起細(xì)胞轉(zhuǎn)入對數(shù)生長期,4~5 d至高峰后轉(zhuǎn)入平臺期,細(xì)胞倍增時(shí)間約39.5 h。4傳代BMSc存在CD44抗原表達(dá),陽性率98.3%,而CD34呈陰性表達(dá)。結(jié)論全骨髓貼壁篩選法是一種獲得高純度BMSCs簡單、有效的方法;在適宜的培養(yǎng)條件下(SD大鼠育齡為2~3 w,接種密度80%~90%培養(yǎng)面,培養(yǎng)基為DMEM/F12,合適血清體積分?jǐn)?shù)為10%,72 h首次全換液)BMSCs在體外生長狀態(tài)良好,增殖速度快,DAPI可作為標(biāo)記BMSCs的一種有效手段,也可作為細(xì)胞免疫組化的基礎(chǔ)染色。
[Abstract]:Objective to investigate the optimal conditions for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from SD rats. Methods Sprague-Dawley rats (SD rats of different weeks) were selected and cultured in different culture medium (L-DMEMU DMEM / F12), serum volume fraction (7.5%), and the first time of fluid exchange (487296 h), method (total exchange, half exchange) by using the method of whole bone marrow adherent screening (L-DMEM-1 / F12), the serum volume fraction (7.5%) and the first time of fluid exchange (487296 h),) were used to culture the SD rats of different weeks (2 weeks, 3 weeks and 4 weeks old), and then cultured in different culture medium (L-DMEMU DMEM / F12). The changes of cell morphology and number were observed under inverted microscope every day. The cells were digested and counted at the time of cell fusion 80 ~ 90. The time to reach the requirement of passage was recorded. The BMSCs growth curve was drawn from the third generation of cells. The expression rate of CD34 and CD44 was detected by immunofluorescence. Results (1) when SD rats reached the requirement of passage at the 2nd week, the number of BMSCs was the most, the time required was the shortest, the content of BMSCs decreased obviously at the 8th week, and it was difficult to form colony growth. The cells in the medium of cell fusion were less than 50% DMEM / F12 and adhered to the wall early. The number of cells in the active L-DMEM medium was slow, and the difference between the two groups was significant (P0.05). The number of cells in the 72 h and 48 h groups was more than that in the control group (P0.05), and the number of the total cells in the 24 h group was less than that in the 24 h group (P0.05), and the number of the mixed cells in the 24 h group was more than that in the control group. The cells were distributed completely, and the increment rate of the two cells was slower than that of the former (P0.05); the higher the volume fraction, the faster the cell growth and differentiation, the shorter the time. However, there was no significant difference between the three groups (P0.05). The cells with high volume fraction in the subculture were easy to be aged by inoculating circular BMSC for 6 h and then differentiated into round cells. After 72 h, there were a few short fusiform cells in round or polygonal cells, and the astrocytes were dispersed. After 6 days, the colony of BMSCs cells were arranged radially, the length and thickness of the cells were irregular, with different pseudopodia, the nucleus of the cells was large, and the nucleoli were clear. After about 10 days, 90% of the cells were fused to 80% of the surface of culture, and within 24 h after passage, the cells were completely attached to the wall. The fusiform cells were covered with 80% or 90% of the surface of culture within 3 days. After 1 or 2 passages, the cells were arranged radially or in parallel. The morphology tended to converge for 2 days, the cells grew slowly, and the cells were transferred to the logarithmic growth period from 4 days to the peak after 3 days of growth stasis. The cell doubling time was about 39.5 h. 4. There was CD44 antigen expression in BMSc. The positive rate was 98.3%, while the expression of CD34 was negative. Conclusion the method of whole bone marrow adherent screening is a simple and effective method for obtaining high purity BMSCs. The culture medium was DMEM / F12, and the appropriate serum volume fraction was 1072 h.) BMSCs grew well in vitro. DAPI could be used as an effective method to label BMSCs, and it could also be used as the basic staining of cell immunohistochemistry.
【作者單位】： 杭州市紅十字會醫(yī)院;大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院;
【基金】：杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)�？茖２】瓶蒲泄リP(guān)專項(xiàng)(20140733Q26)
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2196795