發(fā)布時(shí)間：2018-08-19 13:56

【摘要】：目的：分泌蛋白Equ c1是一種主要過敏原，能夠在大多數(shù)對(duì)馬過敏的病人體內(nèi)誘發(fā)IgE調(diào)節(jié)的I型過敏反應(yīng)，本文旨在探索重組低變應(yīng)原性過敏原Equ c1的研究，為其在特異性免疫治療方面的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。方法：本研究在大腸桿菌中重組表達(dá)了經(jīng)密碼子優(yōu)化之后的成熟肽區(qū)段的Equ c1，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，親和純化和Western-Blot鑒定。利用MHCⅡ Service2.0軟件對(duì)Equ c1的T細(xì)胞主要過敏原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，用定點(diǎn)突變技術(shù)改變Equ c1編碼特定氨基酸的密碼子，，并在大腸桿菌中表達(dá)具有低抗原表位的重組蛋白，對(duì)其進(jìn)行了三級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬和分析以及Western-Blot鑒定。結(jié)果：重組Equ c1-Rosetta菌株在加入濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑0.5μL，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h條件下，能取得最優(yōu)的蛋白表達(dá)效果；重組Equ c1蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，目的條帶在22KDa的位置，純化洗脫中峰和洗脫后峰得到了比較純的目的蛋白。通過對(duì)三個(gè)高抗原表位進(jìn)行單位點(diǎn)突變和組合突變，共表達(dá)一種重組Equ c1蛋白和7種突變的Equ c1蛋白。結(jié)論：改造之后，第50、120、153三個(gè)抗原性最高的九肽與MHCⅡ類分子結(jié)合力都降低到了0.42以下，達(dá)到了我們預(yù)期的效果。三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果顯示，位點(diǎn)突變前后，蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)均沒有發(fā)生明顯變化。利用StrepII tag的Western-Blot結(jié)果表明純化后的重組蛋白與突變蛋白均為目的蛋白。
[Abstract]:Objective: the secretory protein Equ C1 is a major allergen, which can induce type I allergic reaction regulated by IgE in most patients with horse allergy. The aim of this study was to explore the recombinant low allergen Equ C1. To lay a foundation for its application in specific immunotherapy. Methods: in this study, we expressed Equ C1 of mature peptide region after codon optimization in Escherichia coli, and optimized the expression conditions, affinity purification and Western-Blot identification. The T cell epitopes of Equ C1 were predicted by MHC 鈪

本文編號(hào)：2191859