【摘要】：目的構(gòu)建大鼠煙堿樣乙酰膽堿受體α7亞型(α7nAchR)基因短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達載體。方法設(shè)計并合成編碼α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857,并分別與線性化的質(zhì)粒載體pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2,pGenesil-1.3連接,以構(gòu)建可以編碼1條α7nAchR基因shRNA和編碼2條α7nAchR基因shRNA的重組質(zhì)粒載體;重組質(zhì)粒載體感染感受態(tài)的DH5a細胞,提取細菌質(zhì)粒進行特定酶切,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳以鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功;用LR體外同源重組法將AY318、AY444+559、AY857shRNA表達框分別從重組質(zhì)粒pGenesil轉(zhuǎn)移至腺病毒pGSadeno質(zhì)粒表達載體上,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒;用相同的方法感染DH5a細胞,并鑒定重組腺病毒pGSadeno質(zhì)粒是否構(gòu)建成功;提取線性化的重組腺病毒DNA并轉(zhuǎn)染包裝細胞HEK293,經(jīng)放大培養(yǎng)獲得滴度為1.0×1010pfu/mL的重組腺病毒上清;將重組腺病毒感染大鼠GH3垂體瘤細胞,以PCR反應(yīng)鑒定重組腺病毒載體的α7nAchR基因干擾效果。結(jié)果通過酶切片段及其大小,初步判斷AY318、AY857、AY444+559、AY318+857shRNA成功重組入質(zhì)粒載體,重組腺病毒pGSadeno-shRNA包裝成功;重組腺病毒感染HEK293細胞,在熒光顯微鏡下有綠色熒光蛋白表達;重組腺病毒感染GH3細胞后α7nAchR mRNA表達顯著減少,且pGSadeno-AY857shRNA干擾效果最明顯(85%)。結(jié)論具有感染力和干擾大鼠α7nAchR基因表達的shRNA真核表達載體構(gòu)建成功,且pGSadeno-AY857shRNA具有最強的基因干擾效果。
[Abstract]:Objective to construct a rat nicotinic acetylcholine receptor 偽 7 subtype (偽 7nAchR) gene short hairpin RNA (shRNA) eukaryotic expression vector. Methods A DNA template primer AY318- AY857- AY444559AY318 857 encoding 偽 7nAchR gene shRNA was designed and synthesized, and ligated with the linearized plasmid vector pGenesil-1.1 pGenesil-1.2pGenesil-1.2pGenesil-1.3 to construct a recombinant plasmid vector encoding a 偽 7nAchR gene shRNA and two 偽 7nAchR gene shRNA. The recombinant plasmid vector was infected with the competent DH5a cells, the bacterial plasmid was extracted for specific enzyme digestion, and 1% agarose gel electrophoresis was used to identify whether the recombinant plasmid was successfully constructed. The AY318AY444559AY857shRNA expression frame was transferred from the recombinant plasmid pGenesil to the adenovirus pGSadeno plasmid expression vector by LR homologous recombination in vitro, and the recombinant adenovirus plasmid was constructed, and the DH5a cells were infected with the same method. The recombinant adenovirus pGSadeno plasmid was successfully constructed, the linearized recombinant adenovirus DNA was extracted and transfected into the packaging cell line HEK293, and the recombinant adenovirus supernatant with a titer of 1.0 脳 1010pfu/mL was obtained by amplification, and the recombinant adenovirus was infected with rat GH3 pituitary adenoma cells. The interference effect of 偽 7nAchR gene on recombinant adenovirus vector was evaluated by PCR reaction. Results the AY318AY857AY857AY444559AY318 857shRNA was successfully recombined into the plasmid vector, the recombinant adenovirus pGSadeno-shRNA was packaged successfully, the recombinant adenovirus infected HEK293 cells, and the green fluorescent protein was expressed under fluorescence microscope. After the recombinant adenovirus infected GH3 cells, the expression of 偽 7nAchR mRNA was significantly decreased, and pGSadeno-AY857shRNA interference was the most obvious (85%). Conclusion the eukaryotic expression vector of shRNA with infectious and interfering expression of rat 偽 7nAchR gene is successfully constructed, and pGSadeno-AY857shRNA has the strongest effect of gene interference.
【作者單位】： 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科;華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81373872,No.81573785)
【分類號】：R3416

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本文編號：2181641