發(fā)布時間：2018-08-03 19:48

【摘要】：骨髓間充質干細胞(BMMSCs)具有免疫調節(jié)功能,參與多種免疫反應,在體內具有優(yōu)先遷移到受損組織器官發(fā)揮其修復功能的能力�，F(xiàn)階段的BMMSCs體外分離方法是建立在Friedenstein分離方法的基礎上形成的。目前,由于BMMSCs的鑒定沒有一種明確統(tǒng)一的體系,只能從幾個方面綜合分析來作為其鑒定的依據(jù)。丙烯酰胺(ACR)具有致癌性、遺傳毒性以及神經(jīng)毒性。本試驗通過BMMSCs的分離鑒定,建立BMMSCs的體外培養(yǎng)體系,并探討ACR對BMMSCs上ROS、Hsp27以及NFκB通路的影響,以期為ACR的作用機制研究提供一條新的線索。 本文采用全骨髓貼壁法體外分離0-6月齡五指山小型豬BMMSCs,并利用CCK-8檢測其增殖能力。BMMSCs的鑒定是通過細胞形態(tài)學分析、成脂成骨誘導分化潛能鑒定以及CD34/CD45/CD90/CD29/CD44細胞表面抗原的檢測等幾種指標綜合分析。使用0.5mmM的ACR刺激BMMSCs 72 h,分別用ROS檢測試劑盒檢測ROS分泌量、ELISA試劑盒在蛋白水平檢測Hsp27和IL-8表達量、實時定量PCR在mRNA水平上檢測IL-8的表達量、雙熒光素酶系統(tǒng)檢測NFκB通路的激活狀況,并用試劑盒檢測ACR處理前后BMMSCs的細胞周期和凋亡狀況。 結果表明分離得到的五指山小型豬BMMSCs形態(tài)呈梭形或多角形,類似成纖維樣細胞,細胞群體呈旋渦狀生長。成脂、成骨誘導培養(yǎng)21d分別用油紅O及茜素紅染色均呈陽性。流式細胞儀檢測顯示,BMMSCs表達CD90、CD29及CD44,不表達造血干細胞標志性抗原CD34和白細胞標志性抗原CD45。0.5 mM的ACR刺激BMMSCs 72 h后檢測其ROS、Hsp27、IL-8表達量均明顯升高,雙熒光素酶系統(tǒng)檢測到NFκB通路被激活(P0.05)。然而,ACR刺激后BMMSCs的細胞周期和凋亡未見明顯變化。 總之,本文摸索出五指山小型豬BMMSCs一套分離培養(yǎng)體系,通過形態(tài)學分析、分化潛能以及表面抗原三個方面檢測,基本確定其為骨髓間充質干細胞。當0.5 mMACR刺激時,ROS、Hsp27及IL-8表達量均升高,細胞質中NFκB含量顯著升高,說明NFκB通路可能被激活,而細胞凋亡和周期變化不明顯。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) have immunomodulatory function, participate in various immune responses, and have the ability to migrate to damaged tissues and organs in vivo to play their repair function. At present, the method of BMMSCs isolation in vitro is based on the method of Friedenstein separation. At present, the identification of BMMSCs is not a clear and unified system, so it can only be analyzed from several aspects as the basis of its identification. Acrylamide (ACR) is carcinogenic, genotoxic and neurotoxic. Through the isolation and identification of BMMSCs, the in vitro culture system of BMMSCs was established, and the effects of ACR on the rosiform Hsp27 and NF 魏 B pathway on BMMSCs were investigated, in order to provide a new clue for the study of the mechanism of ACR. BMMSCs of 0-6 months old Wuzhishan miniature pig were isolated by whole bone marrow adherent method in vitro. The proliferative ability of BMMSCs was determined by CCK-8. The identification of adipogenic osteogenic differentiation potential and the detection of surface antigen of CD34/CD45/CD90/CD29/CD44 cells were comprehensively analyzed. 0.5mmM ACR was used to stimulate BMMSCs for 72 h. ROS secretion was detected by ROS assay kit and Hsp27 and IL-8 expression was detected by Elisa kit at protein level. IL-8 expression was detected by PCR at mRNA level in real time. The activation of NF 魏 B pathway was detected by double luciferase system, and the cell cycle and apoptosis of BMMSCs before and after treatment with ACR were detected by Kit. The results showed that the BMMSCs of Wuzhishan miniature pig was spindle-shaped or polygonal, similar to fibroblast, and the cell population was swirling. Oil red O and alizarin red were positive for 21 days of osteogenic induction. Flow cytometry analysis showed that BMMSCs expressed CD90, CD29 and CD44, and the expression of ROSS-Hsp27 IL-8 was significantly increased after 72 h stimulation of BMMSCs with ACR that did not express the iconic antigen of hematopoietic stem cell (CD34) and leukocyte iconic antigen (CD45.0.5 mm). NF 魏 B pathway was activated by double luciferase system (P0.05). However, the cell cycle and apoptosis of BMMSCs did not change after ACR stimulation. In a word, a set of isolation and culture system of Wuzhishan mini-pig BMMSCs was found out. It was identified as bone marrow mesenchymal stem cells by morphological analysis, differentiation potential and surface antigen detection. When stimulated with 0.5 mMACR, the expression of Hsp27 and IL-8 increased, and the content of NF 魏 B in cytoplasm increased significantly, indicating that NF 魏 B pathway might be activated, but apoptosis and cell cycle changes were not obvious.
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2162822