【摘要】：隨著生命科學的發(fā)展,待測生物樣品的復雜性越來越高,從而對分析方法的檢測靈敏度、效率、速度、通量及成本提出了更高要求。作為一種新型的熒光探針,量子點具有有機熒光染料和熒光蛋白無法比擬的光學性質,近年來基于量子點的熒光分析法已在生物分析領域得到了廣泛應用。另一方面,作為一種高分辨、高靈敏、高速度、高通量及低樣品消耗的微分離技術,毛細管電泳在生物分析領域也具有廣闊的應用前景。基于此,本論文將上述兩種分析方法進行了結合,建立了一種基于量子點探針和毛細管電泳的分析新方法(即利用量子點作為熒光探針,毛細管電泳熒光檢測作為分析手段,),并重點研究了其在生物分析檢測中應用。論文完成的工作如下： (1)采用毛細管篩分電泳對不同粒徑的水溶性CdSe/ZnS核殼量子點進行了分離,并探討了篩分介質的種類和濃度、緩沖溶液的濃度和pH、分離電壓對量子點分離的影響。在這些因素優(yōu)化條件下,四種不同粒徑的量子點得到了有效分離,且重現(xiàn)性良好,遷移時間的最大相對標準偏差為1.01%,且量子點的電泳淌度和粒徑間存在著很好的相關性(R2=0.997)。實驗證實,這一方法可用于水溶性CdSe/ZnS核殼量子點的粒徑測量。這一工作為量子點粒徑的檢測提供了一種新的方法,同時也為接下來基于毛細管電泳技術和量子點熒光探針的生物分析提供了重要參考。 (2)分別選用發(fā)射波長為532 nm的CdTe量子點和632 nm的CdSe/ZnS量子點作為熒光共振能量轉移體系的供體和受體,通過共價偶聯(lián)的方法將上述兩種量子點分別標記上小鼠1gG和羊抗小鼠1gG,抗原和抗體間的免疫親和作用拉近了兩種量子點間的距離,從而導致供體和受體間熒光共振能量轉移的發(fā)生。我們利用毛細管電泳對上述熒光共振能量轉移進行了分析。實驗中,為了同時檢測兩種量子點的熒光強度變化,我們利用兩個固定檢測波長通道分別對供體和受體的熒光強度進行了同時檢測。在成功地通過毛細管電泳實現(xiàn)熒光共振能量轉移體系與其它“多余”的熒光物得到有效分離的同時,準確測量了供體及受體的熒光強度,并計算了不同濃度受體情況下的熒光共振能量轉移效率(38.56-69.58%),這一效率比常規(guī)的熒光強度測量法得到的熒光共振能量轉移效率(12.77-52.37%)有一定程度的提高,而且對熒光共振能量轉移的觀察更加直觀,靈敏度更高,樣品消耗更少。這一工作為熒光共振能量轉移的研究提供了一種新的分析方法。 (3)分別利用親和素-生物素系統(tǒng)及直接共價偶聯(lián)的方法將熒光發(fā)射波長為585和650 nm的CdTe量子點與兩種具有不同堿基序列的分子信標進行了連接,構建得到了兩種量子點-分子信標探針。量子點-分子信標探針與不同靶標雜交后的毛細管電泳結果表明,這兩種量子點-分子信標探針都只與和其環(huán)狀部分序列完全互補的靶標特異性雜交,且都具有對單堿基突變識別的能力。利用這兩種量子點-分子信標探針,我們借助毛細管電泳成功地實現(xiàn)了對特定核酸序列兩個位點單堿基突變的同時檢測。這一研究不僅為今后多位點的核酸單堿基突變檢測提供了重要手段,而且在諸如核酸高靈敏度檢測及單核苷酸多態(tài)性研究領域中也有很廣泛的應用前景。 (4)分別將CdSe/ZnS量子點及金納米顆粒與不同堿基長度的互補DNA單鏈進行了偶聯(lián),并通過DNA鏈的互補雜交將量子點與金納米顆粒連接到一起,構建得到了一個研究溶液中金屬增強量子點熒光的模型,然后利用毛細管電泳考察了金納米顆粒和量子點間的距離對量子點熒光增強的影響。實驗結果表明溶液中的金納米顆粒增強量子點熒光有很強的距離依賴性,只有與金納米顆粒與量子點相距6.8-18.7nm時,量子點才出現(xiàn)熒光增強效應,其中11.9 nm是金納米顆粒增強量子點熒光的最佳距離,此時量子點的熒光強度增強為原來的2.3倍。接下來,我們在量子點和納米金顆粒相距11.9 nm的體系中加入與量子點偶聯(lián)的DNA鏈相同堿基序列的目的DNA,利用目的DNA與量子點-DNA間的特異性競爭,實現(xiàn)了對19.6 pg(15 nM)目的DNA的檢測。這一工作不僅為今后溶液中金屬增強量子點熒光的研究提供了重要參考,而且在諸如DNA雜交分析及高靈敏度DNA檢測等領域也有很廣泛的應用前景。
[Abstract]:With the development of life science, the complexity of the biological samples to be measured is becoming more and more complex, which puts forward higher requirements for the detection sensitivity, efficiency, speed, flux and cost of the analytical methods. As a new type of fluorescence probe, the quantum dots have the optical properties incomparable with the organic fluorescent dyes and the fluorescent egg white. In recent years, the quantum dots are based on the quantum dots. Fluorescence analysis has been widely used in the field of biological analysis. On the other hand, as a differential separation technology with high resolution, high sensitivity, high speed, high throughput and low sample consumption, capillary electrophoresis has a broad application prospect in the field of biological analysis. Based on this, the above two analytical methods are combined and established in this paper. A new analytical method based on quantum dot probe and capillary electrophoresis (using quantum dots as a fluorescent probe, capillary electrophoresis fluorescence detection as an analytical method), and its application in bioanalysis and detection is studied. The work completed in this paper is as follows:
(1) the capillary sieving electrophoresis was used to separate the water soluble CdSe/ZnS core shell quantum dots with different particle sizes, and the types and concentrations of the sieve medium, the concentration of the buffer solution and the pH, the effect of the separation voltage on the separation of the quantum dots were discussed. Under these conditions, the quantum dots of four different particle sizes were effectively separated and reproduced. The maximum relative standard deviation of the migration time is 1.01%, and there is a good correlation between the electrophoretic mobility and the particle size of the quantum dots (R2=0.997). The experiment proves that this method can be used to measure the particle size of the water soluble CdSe/ZnS nuclear point quantum dots. It provides an important reference for bioanalysis based on capillary electrophoresis and quantum dots fluorescent probes.
(2) the CdTe quantum dots with emission wavelength of 532 nm and the CdSe/ZnS quantum dots of 632 nm are used as donors and receptors of the fluorescence resonance energy transfer system. The above two quantum dots are labeled on the mice 1gG and the Sheep anti mouse 1gG respectively by covalent coupling method, and the immune affinity between the antigen and the antibody is close to two quantum dots. Distance, which leads to the occurrence of fluorescence resonance energy transfer between the donor and the receptor. We analyzed the above fluorescence resonance energy transfer by capillary electrophoresis. In order to detect the fluorescence intensity changes of the two quantum dots at the same time, we used two fixed detection wavelength channels to carry out the fluorescence intensity of the donor and the receptor respectively. At the same time, the fluorescence resonance energy transfer efficiency (38.56-69.58%) of the donor and the receptor was measured accurately, while the fluorescence resonance energy transfer system was successfully separated from other "excess" fluorescence by capillary electrophoresis. The fluorescence resonance energy transfer efficiency (12.77-52.37%) obtained by the fluorescence intensity measurement method is improved to a certain extent, and the observation of the fluorescence resonance energy transfer is more intuitive, the sensitivity is higher, and the sample consumption is less. This work provides a new analytical method for the study of fluorescence resonance energy transfer.
(3) using the avidin biotin system and the direct covalent coupling method, the CdTe quantum dots with the fluorescence emission wavelength of 585 and 650 nm were connected with the two molecular beacons with different base sequences, and two quantum dot molecular beacons were constructed and the capillaries of the quantum dot sub beacon probe hybridized with the different targets were obtained. The results of tube electrophoresis show that these two quantum dots - molecular beacon probes are only specific to the targets that are completely complementary to their ring part sequences, and all have the ability to recognize single base mutations. Using these two quantum dots - molecular beacon probes, we have accomplished two loci of specific nucleic acid sequences by capillary electrophoresis. The simultaneous detection of single base mutation has not only provided an important means for the detection of single nucleotide mutation in multiple sites in the future, but also has a wide application prospect in the field of high sensitivity detection and single nucleotide polymorphisms.
(4) the CdSe/ZnS quantum dots and gold nanoparticles were coupled with the complementary DNA single strand of different base lengths, and the quantum dots were connected to gold nanoparticles through the complementary hybridization of the DNA chain. A model was constructed to study the fluorescence of the metal enhanced quantum dots in the solution. Then the gold nanoparticles were investigated by capillary electrophoresis. The effect of the distance between the particles and the quantum dots on the fluorescence enhancement of the quantum dots. The experimental results show that the fluorescence of the gold nanoparticles in the solution has a strong distance dependence. Only when the gold nanoparticles and the quantum dots are apart from 6.8-18.7nm, the quantum dots appear to be enhanced by the fluorescence enhancement, and the 11.9 nm is a gold nanoparticle enhanced quantum dot fluorescein. At the best distance of the light, the fluorescence intensity of the quantum dots is enhanced to 2.3 times that of the original. Then, we add the same base sequence of the DNA chain to the quantum dots in the system of quantum dots and the nano gold particles 11.9 nm apart, and use the specific competition between the target DNA and the quantum dot -DNA to achieve the DNA of the 19.6 PG (15 nM). This work not only provides an important reference for the study of metal enhanced quantum dot fluorescence in the future, but also has a wide range of applications in the fields such as DNA hybridization analysis and high sensitivity DNA detection.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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