【摘要】：神經肽Y（Neuropeptide Y，NPY）是一種由36個氨基酸組成，結構類似于鳥胰多肽（avian pancreatic polypeptide，APP）及多肽YY（peptide YY）的一種神經遞質，其豐富地表達于中樞和外周神經系統(tǒng)。當交感神經激活時，NPY可與去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）共同被交感神經末梢所釋放。NPY通過六種不同的G蛋白偶聯(lián)受體在體內發(fā)揮著廣泛的作用。在中樞，NPY可影響學習、記憶、攝食等功能；而在外周，它對循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)均產生影響。 肝臟是人體最大的腺體，是新陳代謝的重要器官。肝臟被大量的傳入神經和傳出神經（交感和副交感神經）所支配。研究表明，在人類肝臟中，NPY能神經元是人體肝臟中最為豐富的肽能神經元。NPY能神經元大量分布于肝動脈、門靜脈以及膽道周圍，并且直接貫穿于肝小葉，與肝細胞直接接觸，從而形成一個復雜的神經網絡。有研究報道交感神經能夠通過末梢釋放NPY和NE調節(jié)肝血管的血液量，而NPY對肝細胞的作用卻鮮有報道。 基于納升級二維液相-串聯(lián)質譜（2D-nano-LC-MS/MS）的鳥槍法蛋白組學研究技術是指將目標蛋白組進行酶解形成混合肽段后，采用納升級二維液相色譜對肽段混合物進行分離，接著通過串聯(lián)質譜逐一檢測特征性肽段，所得數(shù)據(jù)運用SEQUEST等軟件進行數(shù)據(jù)分析，從而高通量、高靈敏度和高精度地對蛋白質進行鑒定。 為研究NPY對肝細胞的作用及其分子機制，我們以人肝細胞L-02為研究對象，進行了以下工作： 1、采用MTT法測定不同濃度的NPY對人肝細胞L-02活力的影響。 2、應用Western blot檢測NPY刺激人肝細胞L-02后凋亡標志性蛋白的變化。 3、應用基于納升級二維液相-串聯(lián)質譜的鳥槍法蛋白組學技術研究人肝細胞L-02在經過NPY刺激后，其蛋白表達譜的變化，從中挖掘NPY引起人肝細胞凋亡的信號通路； 4、應用生物信息學軟件分析蛋白組數(shù)據(jù)，同時查閱文獻，篩選與凋亡密切相關的蛋白，發(fā)掘NPY引起人肝細胞凋亡的可能信號通路，并應用Western blot對部分蛋白的表達變化進行驗證； 5、應用mTOR的抑制劑雷帕霉素，進一步觀察mTOR信號通路在NPY引起人肝細胞凋亡中的作用。 主要工作結果如下： 1、 NPY可呈劑量依賴性明顯降低人肝細胞L-02的活力，且1nM NPY即具有顯著作用。 2、 NPY可導致L-02細胞凋亡標志性蛋白表達發(fā)生明顯變化，L-02細胞在經過NPY的刺激后，其剪切caspase-3表達上調，Bcl-2家族中Bax、Bad表達上調，Bcl-2表達下調。結果顯示，NPY可引起L-02細胞的凋亡。 3、應用基于納升級二維液相-串聯(lián)質譜的鳥槍法蛋白組學研究技術，10nM的NPY刺激L-02細胞后，，有317個蛋白的表達呈現(xiàn)差異，其中80個蛋白表達上調，237個蛋白表達下調。經過查閱篩選，與凋亡密切相關的蛋白有12個，我們關注其中的4個蛋白，即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），細胞色素c（cytochrome c），核糖體蛋白S6激酶（S6K）和熱休克蛋白70（Hsp70）。mTOR可通過激活S6K而磷酸化BAD，Hsp70可通過JNK來調節(jié)cytochrome c的釋放，而cytochrome c則能夠活化caspase-9從而剪切caspase-3，引起細胞的凋亡。 4、經Western blot的進一步驗證，mTOR、cytochrome c、S6K和Hsp70的表達與納升級二維液相-串聯(lián)質譜所檢測的表達模式一致，mTOR、S6K、cytochrome c表達上調，Hsp70表達下調。 5、應用mTOR的抑制劑雷帕霉素后，NPY引起L-02細胞的凋亡被逆轉。 綜上所述，NPY可呈劑量依賴地促進人肝細胞的凋亡。10nM NPY刺激L-02細胞24h后，12個與凋亡相關的蛋白發(fā)生變化，其中4個具有密切的聯(lián)系，我們進一步推測mTOR/S6K/BAD、Hsp70/cytochrome c/caspase-3可能是NPY引起人肝細胞凋亡的兩條重要信號通路。應用mTOR抑制劑雷帕霉素后進一步表明，雷帕霉素可以逆轉NPY的促人肝細胞凋亡作用。研究表明，NPY可通過激活人肝細胞內在凋亡通路而使其凋亡，同時基于納升級二維液相-串聯(lián)質譜的鳥槍法蛋白組學是一種有效的挖掘信號通路的方法。
[Abstract]:Neuropeptide Y ( NPY ) is a neurotransmitter composed of 36 amino acids , which is similar to that of bird pancreatic polypeptide ( APP ) and polypeptide YY ( peptide YY ) , which is abundantly expressed in the central and peripheral nervous system . NPY can be released by sympathetic nerve endings in combination with noradrenaline ( NE ) when sympathetic nerve is activated . NPY plays a wide role in vivo by six different G protein coupled receptors . NPY can influence learning , memory and food consumption .
At the periphery , it has an impact on circulatory system , reproductive system and digestive system .

The liver is the largest gland in the human body and is an important organ of metabolism . The liver is dominated by a large number of afferent nerves and afferent nerves ( sympathetic and subsympathetic nerve ) . The study shows that NPY - ergic neurons are the most abundant peptide - energy neurons in human liver . NPY - ergic neurons are distributed directly around the hepatic artery , portal vein and biliary tract , thus forming a complex neural network . It is reported that the sympathetic nerve can release NPY and NE through the distal tip to regulate the blood volume of the liver blood vessel , and NPY has little effect on the liver cells .

Based on nanoscaled 2D - nano - LC - MS / MS , the technique of protein group is to separate the peptide segment mixture by nano - escalation two - dimensional liquid chromatography , then the characteristic peptide segment is detected one by one by tandem mass spectrometry , and the data is analyzed by using software such as EST , so that the protein can be identified with high flux , high sensitivity and high accuracy .

In order to study the effect of NPY on liver cells and its molecular mechanism , we performed the following work with human hepatocytes L - 02 as the research object :

1 . The effect of NPY on the activity of human hepatocytes L - 02 was determined by MTT assay .

2 . Western blot was used to detect the changes of apoptosis marker protein in human hepatocytes after L - 02 .

3 . The protein expression profile of human hepatocytes L - 02 after NPY stimulation was studied by the technique of nanogun proteomic technique based on nano - escalation two - dimensional liquid - tandem mass spectrometry .


4 . Using bioinformatics software to analyze the proteome data , meanwhile , consult the literature , screen the protein related to apoptosis , explore the possible signal pathway of NPY - induced apoptosis of human hepatocytes , and verify the expression of some proteins by Western blot ;


5 . Using rapamycin inhibitor rapamycin , we further observed the role of mtor signaling pathway in NPY - induced apoptosis in human hepatocytes .

The main results are as follows :

1 . NPY may dose - dependently decrease the viability of human hepatocytes L - 02 and 1 nM NPY has a significant effect .

2 . NPY could induce apoptosis of L - 02 cells . The expression of caspase - 3 was up - regulated in L - 02 cells . The expression of Bax , Bad in Bcl - 2 family was up - regulated and the expression of Bcl - 2 was down - regulated .

3 . The expression of 317 proteins was differentially expressed after 10 nM NPY - stimulated L - 02 cells . Among these proteins , there were 12 proteins , including mammalian rapamycin target protein , cytochrome c , ribosomal protein S6 kinase and heat shock protein 70 ( Hsp70 ) .

4 . After further verification by Western blot , the expression of mtor , cdc , s6k and Hsp70 was consistent with the expression pattern detected by nano - escalation two - dimensional liquid - tandem mass spectrometry , and the expression of mtor , s6k , cdc was up - regulated , and the expression of Hsp70 was down regulated .

5 . NPY causes apoptosis of L - 02 cells to be reversed after rapamycin is applied to rapamycin .

In conclusion , NPY can promote apoptosis of human hepatocytes in a dose - dependent manner . After 10 nM NPY - stimulated L - 02 cells for 24 h , 12 cells related to apoptosis have changed . Four of them have close ties . We further speculated that the expression of Hsp70 / bcl - c / caspase - 3 might be an important signaling pathway for the apoptosis of human hepatocytes .
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2128175