【摘要】：目的：研究破骨細胞骨吸收活動中的分泌產(chǎn)物對成骨細胞增殖、分化及成骨功能的影響,以了解活化的破骨細胞在體外對成骨細胞的影響；并確定其發(fā)生作用的信號通路,以期為治療牙槽骨吸收提供新的治療靶點。 方法：誘導小鼠RAW264.7細胞為破骨細胞,用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和破骨細胞特異性基因檢測鑒定。破骨細胞與牛骨磨片共培養(yǎng),甲苯胺藍染色。收集共培養(yǎng)上清液作用于小鼠MC3T3-E1細胞,用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法、酶聯(lián)免疫吸附法、茜素紅染色及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測細胞的增殖、骨鈣素水平、礦化及成骨特征基因的表達；共培養(yǎng)上清液及P13K特異性抑制劑作用于小鼠MC3T3-E1細胞后,蛋白免疫印跡實驗(western-bolt)檢測相關(guān)信號蛋白的表達。結(jié)果：TRAP染色、破骨細胞特異性基因檢測及甲苯胺藍染色,表明RAW264.7細胞可分化為具骨吸收能力的破骨細胞。破骨細胞骨吸收上清液作用,MC3T3-E1細胞增殖受抑制(OD值在0.062±0.004和0.405士0.033之間,P0.05)。骨鈣素水平增高(第10日上清組的骨鈣素濃度為2.965±0.047μg/L),鈣化結(jié)節(jié)增多,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor2, Runx2)的轉(zhuǎn)錄增強。破骨細胞骨吸收上清作用后MC3T3-E1細胞中P13K的調(diào)節(jié)亞基P-P85及P13K信號通路下游分子P-AKT表達顯著增加(P0.05)。特異性抑制劑LY294002阻斷后,P-P85及P-AKT均出現(xiàn)了劑量依賴性的降低,且都低于上清處理組(P0.05)。 結(jié)論：RAW264.7破骨細胞骨吸收上清液具有抑制成骨樣細胞增殖,促進分化和鈣化成骨的作用。破骨細胞骨吸收上清促進小鼠MC3T3-E1細胞的分化作用是通過PI3K信號通路產(chǎn)生的。
[Abstract]:Aim: to study the effects of the secretory products of osteoclast bone resorption on the proliferation, differentiation and osteogenic function of osteoblasts in order to understand the effect of activated osteoclasts on osteoblasts in vitro, and to determine the signaling pathway of their action. In order to provide a new therapeutic target for alveolar bone resorption. Methods: mouse RAW264.7 cells were induced to be osteoclasts and identified by tartrate resistant acid phosphatase-trap staining and osteoclast specific gene detection. Osteoclasts were co-cultured with bovine bone mill and stained with toluidine blue. Mouse MC3T3-E1 cells were treated with co-cultured supernatants. The proliferation and osteocalcin levels of MC3T3-E1 cells were detected by (methyl thiazolyl tetrazolium, assay, enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa), alizarin red staining and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). After co-culture supernatant and P13K specific inhibitor acted on mouse MC3T3-E1 cells, Western blot assay (western-bolt) was used to detect the expression of related signal proteins. Results the results showed that RAW264.7 cells could differentiate into osteoclasts with bone resorption ability. The results showed that RAW264.7 cells could be differentiated into osteoclasts with bone resorption ability by the detection of specific genes of osteoclasts and toluidine blue staining. Bone resorption supernatant of osteoclasts inhibited the proliferation of MC3T3-E1 cells (OD values were 0.062 鹵0.004 and 0.405 鹵0.033 respectively, P0.05). The level of osteocalcin increased (the concentration of osteocalcin was 2.965 鹵0.047 渭 g / L), the number of calcified nodules increased, and the transcription of alkaline phosphatase (alkaline phosphatase,) and Runt related transcription factor 2 (runt related transcription factor-2 (Runx2) were increased in the 10th day supernatant group. The expression of P13K regulatory subunit P-P85 and the downstream molecule P-AKT of P13K signaling pathway were significantly increased in MC3T3-E1 cells treated with osteoclast bone resorption supernatant (P0.05). Both P-P85 and P-AKT decreased in a dose-dependent manner after blocking LY294002 and were lower than those in supernatant treatment group (P0.05). Conclusion the supernatant of bone resorption of osteoclasts from the osteoclasts can inhibit the proliferation of osteoblasts and promote the differentiation and calcification of osteoblasts. The bone resorption supernatant of osteoclasts promotes the differentiation of mouse MC3T3-E1 cells through PI3K signaling pathway.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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