本文選題：HMBOX1 + 單克隆抗體　； 參考：《山東大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：研究目的 本課題涉及一種新的功能性基因-HMBOX1的研究。HMBOX1屬于Homeobox家族成員,其蛋白N端帶有homeobox結(jié)構(gòu)域,C端帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。到目前為止,HMBOX1已發(fā)現(xiàn)兩種異構(gòu)體,HMBOX1和HMBOX1b(缺失Homeobox結(jié)構(gòu)域)。HMBOX1基因在不同種屬中具有高度保守性,在人類可表達(dá)于18種組織中,其中在胰腺、腦、肝臟、腎臟等組織中高表達(dá),既可表達(dá)在細(xì)胞漿,也可表達(dá)于細(xì)胞核。HMBOX1是一種潛在的轉(zhuǎn)錄抑制因子,本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)HMBOX1基因?qū)ψ匀粴?xì)胞具有明顯的調(diào)控作用。對HMBOX1具體功能的研究,不僅可以揭示這個新基因的功能,而且可以為進(jìn) 一步了解NK細(xì)胞發(fā)育和功能調(diào)節(jié)過程奠定基礎(chǔ)。新型轉(zhuǎn)錄因子的研究,特別是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和相互作用的研究離不開高特異性的抗體。本研究擬通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HMBOX1重組蛋白并制備其單克隆抗體,然后利用高特異性抗體研究HMBOX1的特征和功能。 1.首先構(gòu)建HMBOX1原核表達(dá)載體,然后通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組融合蛋白。 2.原核蛋白常以包涵體形式存在,所以對重組蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性條件優(yōu)化。 3.以具有天然構(gòu)象的重組蛋白為抗原,通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。 4.確定單克隆抗體的特征并驗(yàn)證單抗的特異性。 5.鑒定單克隆抗體的應(yīng)用范圍。 6.應(yīng)用制備的單抗研究HMBOX1在人體組織中的表達(dá)并初步研究其功能。 研究方法 1.PCR及RT-PCR構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET22b-HMBOX 1-6His。 2.原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)。 1mM IPTG,37℃4h誘導(dǎo)E. coli Rosetta (DE3)菌株中HMBOX1重組蛋白的表達(dá)。 3.Ni2+親和層析純化和復(fù)性重組HMBOX1蛋白 利用重組蛋白6His標(biāo)簽蛋白,Ni2+親和層析純化蛋白,并通過梯度稀釋的尿素復(fù)性結(jié)合在固相凝膠上包涵體蛋白。 4.制備酸處理裸菌 以鼠傷寒桿菌為基礎(chǔ)經(jīng)稀醋酸處理得到裸菌,作為免疫佐劑。 5.免疫接種動物和雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。 6.注射腹水大量制備單克隆抗體。 7. ELISA和競爭性ELISA鑒定抗體的效價(jià)和親和力。 8. SDS-PAG鑒定重組蛋白的表達(dá)。 9.免疫標(biāo)記技術(shù)檢測組織和細(xì)胞中HMBOX1的表達(dá)。 通過Western blot免疫印跡技術(shù)、免疫組化技術(shù)(細(xì)胞爬片,組織芯片)檢測細(xì)胞和組織中HMBOX1的表達(dá)情況；通過免疫熒光技術(shù)結(jié)合顯微鏡檢測HMBOX1的細(xì)胞定位；免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測HMBOX1的胞內(nèi)表達(dá)。 10.免疫共沉淀技術(shù)檢測單克隆抗體的應(yīng)用并檢測肝細(xì)胞系中HMBOX1的表達(dá)。 研究結(jié)果 1.重組HMBOX1蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性 1.1原核重組表達(dá)載體pET22b-HMBOX1-6His的構(gòu)建 首先,通過RT-PCR制備人自然殺傷細(xì)胞系NK-92細(xì)胞cDNA,利用HMBOX1特異性引物和高保真Ex Taq酶擴(kuò)增得到人HMBOX1基因的蛋白編碼序列,通過測序驗(yàn)證基因序列。然后以此為模板,重新設(shè)計(jì)引物得到改造的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與載體pET22b連接,構(gòu)建得到表達(dá)產(chǎn)物C端帶有信號肽引導(dǎo)序列和6×His標(biāo)簽蛋白的pET22b-HMBOX1表達(dá)載體。 1.2重組蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性 將構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E. coli Rosetta (DE3)菌株,此菌株能夠表達(dá)含有大量稀有堿基的人體蛋白。實(shí)驗(yàn)表明,通過1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以不可溶的包涵體形式存在。為獲得具備天然構(gòu)象的HMBOX1,重組蛋白經(jīng)鎳親和層析技術(shù)同步純化和復(fù)性,復(fù)性采用濃度梯度降低的尿素灌流液流經(jīng)親和柱,使吸附在固相載體上的蛋白重新折疊,最后收集重新折疊的重組HMBOX1蛋白。然后質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白測序,驗(yàn)證了復(fù)性HMBOX1蛋白的序列正確性。另外,非變性聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳證實(shí),重組蛋白具備了天然構(gòu)象并可形成二聚體,說明重組蛋白可能具有HMBOX1的天然構(gòu)象。 2. HMBOX1單克隆抗體的制備 2.1單克隆抗體的制備 以酸處理的鼠傷寒桿菌裸菌作為佐劑與復(fù)性重組HMBOX1蛋白一起免疫接種小鼠。蛋白質(zhì)抗原可以吸附在酸處理裸菌上,表明可增強(qiáng)其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到一定程度時(shí),應(yīng)用雜交瘤技術(shù),獲得兩株HMBOX1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞：2A5F4和4A4F2。 2.2單克隆抗體的特征及應(yīng)用研究 免疫球蛋白類型鑒定證明：2A5F4株單抗為IgG2b/K類型,4A4F2株單抗為IgM/κ類型。ELISA和競爭性ELISA試驗(yàn)表明：純化的2A5F4株單抗的效價(jià)和親和力分別為1.024×10-5和3.67×108M-1；純化的4A4F2株單抗的效價(jià)和親和力分別為5×10-5和3.35×108M-1。這兩株抗體具備較高的靈敏度并能特異性地和原核蛋白以及天然構(gòu)象真核蛋白結(jié)合。經(jīng)免疫印跡和免疫組化分析驗(yàn)證,4A4F2株抗體能檢測到HMBOX1在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)變化,即在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMBOX1的細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)增加,在轉(zhuǎn)染siRNA/HMBOX1的細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)降低。而2A5F4株單抗僅能應(yīng)用于免疫組化技術(shù)的檢測。因此,這兩株單抗可與具有天然構(gòu)象的真核蛋白發(fā)生特異性結(jié)合并能應(yīng)用于免疫印跡和免疫組化的檢測分析。另外,制備的單克隆抗體可應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)檢測和免疫共沉淀等多種免疫分析技術(shù),為HMBOX1的體外作用機(jī)制研究提供了可靠的技術(shù)支持。尤其是2A5F4和4A4F2分別作為共沉淀抗體和免疫印跡抗體可以對肝臟細(xì)胞中的HMBOX1進(jìn)行免疫共沉淀分析,為進(jìn)一步HMBOX1的靶基因研究和蛋白質(zhì)相互作用研究提供了技術(shù)保障。 3.人體組織中HMBOX1表達(dá)譜研究及腫瘤表達(dá)差異性研究 3.1細(xì)胞內(nèi)HMBOX1蛋白的定位和組織分布 利用制備的高特異性單克隆抗體,通過免疫熒光技術(shù)研究HEK-293T細(xì)胞中HMBOX1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HMBOX1蛋白同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核,這也表明HMBOX1發(fā)揮生理作用的可能機(jī)制為從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。 以人體組織石蠟切片和組織芯片為研究對象,發(fā)現(xiàn)HMBOX1在多種人體組織中表達(dá),特別在腎臟,大腦,甲狀腺,胃,腸,肝,胰腺,肺,心臟肌肉,睪丸和前列腺等組織表達(dá)量較高。 3.2 HMBOX1在人體正常組織和腫瘤組織中表達(dá)譜的差異 HMBOX1可在多類型腫瘤組織中表達(dá)。與癌旁組織相比,在一些腫瘤中存在差異表達(dá)。肝癌組織中的HMBOX1蛋白水平比癌旁組織顯著性的減少；腎臟組織中的HMBOX1主要表達(dá)在腎小管,而在腎小球中表達(dá)很低,特別在腎小管來源的腎透明細(xì)胞癌腫高度表達(dá)；胰腺組織和腫瘤中都可見HMBOX1的高度表達(dá),但未發(fā)現(xiàn)明顯差異。HMBOX1在肝癌細(xì)胞中表達(dá),這為進(jìn)一步研究HMBOX1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供了細(xì)胞研究模型。 研究結(jié)論 1.成功構(gòu)建了重組人HMBOX1原核表達(dá)載體pET22b-HMBOX 1-6His。 2.在E. coli Rosetta (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)了重組HMBOX1蛋白,并利用His親和層析的方法對HMBOX1包涵體蛋白成功的進(jìn)行了復(fù)性。復(fù)性蛋白具有HMBOX1的天然構(gòu)象。 3.制備了兩株特異性HMBOX1單克隆抗體：2A5F4和4A4F2。 4.兩株單抗可特異性識別真核構(gòu)象HMBOX1,并應(yīng)用于、vestern blot和免疫組化檢測。 5. HMBOX1既可以表達(dá)在細(xì)胞漿也可以表達(dá)于細(xì)胞核。 6. HMBOX1在多種組織中高表達(dá),如肝臟、腎臟、胰腺和腦組織。 7. HMBOX1在多種腫瘤組織中存在差異表達(dá),特別是正常肝臟組織中的表達(dá)顯著高于肝癌組織中的表達(dá)。 8.肝細(xì)胞系HMBOX1的表達(dá)研究為闡明肝臟和肝癌中HMBOX1的功能提供了技術(shù)支持。 研究意義 本課題建立了一種HMBOX1原核蛋白表達(dá)、純化和復(fù)性的有效方案,并在此基礎(chǔ)上制備獲得兩株高特異性單克隆抗體。這兩株單克隆抗體可用于多種免疫檢測分析,為進(jìn)一步研究HMBOX1的功能奠定了基礎(chǔ)。另外,HMBOX1作為一種轉(zhuǎn)錄因子,可能參與了腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制,并可能對糖物質(zhì)代謝具有調(diào)控作用。所以,HMBOX1的功能和作用機(jī)制有待于本課題組進(jìn)行深入研究。
[Abstract]:Purpose of study


HMBOX1 is a member of the Homeobox family . The N - terminus of HMBOX1 is a member of the Homeobox family . The N - terminus of HMBOX1 is highly conserved in different species . HMBOX1 is highly conserved in tissues of different species . HMBOX1 is a potential transcription - inhibiting factor .


This study is intended to express HMBOX1 recombinant protein through prokaryotic expression system and to prepare its monoclonal antibody , then to study the features and functions of HMBOX1 by high specific antibody .


1 . firstly constructing a HMBOX1 prokaryotic expression vector , and then obtaining the recombinant fusion protein through a prokaryotic expression system .


2 . The prokaryotic protein is usually in the form of inclusion body , so the recombinant protein is purified and optimized .


3 . A monoclonal antibody is prepared by hybridoma technology by using a recombinant protein with natural conformation as an antigen .


4 . Determine the characteristics of the monoclonal antibody and verify the specificity of the monoclonal antibody .


5 . Identification of the application range of monoclonal antibodies .


6 . The expression of HMBOX1 in human tissues was studied and its function was studied .


Research Methods


1 . The prokaryotic expression vector pET22b - HMBOX 1 - 6His was constructed by PCR and RT - PCR .


2 . Induced expression of prokaryotic expression vector .


The expression of HMBOX1 recombinant protein in E . coli Rosetta ( DE3 ) strain was induced by IPTG at 37 鈩，

本文編號：2077662