本文選題：漢坦病毒 + 進(jìn)化��； 參考：《武漢大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目的： 研究近年來(lái)流行在湖北地區(qū)的漢坦病毒的基因特征,并構(gòu)建不同型別漢坦病毒假病毒,從而為進(jìn)一步研究漢坦病毒G蛋白的功能提供新的手段。 方法： 1.湖北江夏地區(qū)鼠肺標(biāo)本、HFRS患者血清的收集及篩選：獲取2009-2011年間江夏區(qū)的6個(gè)采樣點(diǎn)(胡家村、姚家灣、段嶺廟、敖家邊、山坡和張家灣)的鼠肺標(biāo)本；并收集2009-2011年間江夏區(qū)臨床診斷為腎綜合征出血熱(HFRS)的患者血清標(biāo)本。利用間接免疫熒光(IFA),空斑減數(shù)中和實(shí)驗(yàn)(FRNT)以及RT-PCR對(duì)收集的樣本進(jìn)行篩選。 2.用RT-PCR法對(duì)病毒基因進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序,用MEGA等生物學(xué)軟件對(duì)病毒的部分S片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。了解江夏區(qū)漢坦病毒流行的型別、基因特征。 3.采用漢坦病毒感染乳BALB/c小鼠,對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行病毒分離、傳代,獲得病毒株。并進(jìn)行全基因組測(cè)序,用生物學(xué)軟件分析其基因組特征。 4.利用VSV△G-GFP (Luciferase)骨架分別構(gòu)建含無(wú)名病毒(SNV),安第斯病毒(ANDV),漢灘病毒(HTNV)以及希望山病毒(PHV)的漢坦病毒假病毒,并對(duì)其感染性進(jìn)行研究。 5.用相應(yīng)的HFRS/HPS抗血清,單克隆抗體等對(duì)這些漢坦病毒假病毒的抗原性進(jìn)行研究。同時(shí)用受體特異性的抑制劑與其作用,觀察假病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式,并與漢坦病毒原型分離株進(jìn)行比較。 6.構(gòu)建致病性(SNV)和非致病性(PHV)嵌和G蛋白的漢坦病毒假病毒(即：SNVGn與PHVGc組合形成嵌和G蛋白,PHVGn與SNV Gc組合形成嵌合G蛋白)。并用漢坦病毒肺綜合征(HPS)病人的抗血清與之反應(yīng)檢測(cè)其抗原性。 7.用抗體與HV004G蛋白構(gòu)建的漢坦病毒假病毒反應(yīng),然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。另外用阿比朵爾作用Vero-E6細(xì)胞后,再加入假病毒,觀察其抑制效果。 結(jié)果： 1.捕獲動(dòng)物的帶毒率及血清陽(yáng)性率：共捕獲173只動(dòng)物,包括黑線姬鼠48只,褐家鼠125只,從3只褐家鼠和4只黑線姬鼠中檢測(cè)到了漢坦病毒核酸,鼠肺標(biāo)本中漢坦病毒核酸總檢出率為4.05%。同時(shí)收集到11份HFRS病人血清,從其中的10份檢測(cè)到了HTNV或SEOV中和抗體(有2份檢測(cè)出漢坦病毒核酸)。 2.所有漢坦病毒陽(yáng)性標(biāo)本部分S片段的測(cè)序結(jié)果：江夏地區(qū)鼠間流行漢坦病毒為HTNV和SEOV型,進(jìn)化分析顯示,來(lái)自褐家鼠的漢坦病毒基因序列(JX1143、JX0937、JX1018和JX1028)與SEOV (Z37、ZT10株等)形成一簇,屬于SEOV型。從黑線姬鼠中擴(kuò)增出的漢坦病毒序列(HV003、HV004和HV005)和兩個(gè)從HFRS病人中得到的病毒序列(s200903和s201012),屬于HTNV型,組成一個(gè)新的分枝。 3.對(duì)分離得到的HV004株全基因組測(cè)序結(jié)果顯示：HV004屬于HTNV型漢坦病毒,其全基因序列與其它HTNV (76-118, A9, CGHu2, CGRn45, Q32株等)比較,核酸的同源性為83%-90%,推導(dǎo)出氨基酸的同源性為95%-99%。對(duì)S,M和L全序列分析均表明HV004株為一個(gè)獨(dú)立的分枝。在分離過(guò)程中,經(jīng)BALB/c乳鼠傳3代后,僅在S片段3’非編碼區(qū)有一處發(fā)生了堿基突變,但其致病性沒(méi)有變化。 4.VSV-G假病毒的滴度從(?)3X105IU/ml (VSV△G-ANDV-GFP)到2×107IU/ml(VSV△G-VSV-GFP)。 VSV G-luc(?)段病毒顆粒與野生的VSV一樣有著彈狀外形,VSV△G-luc-HTNV平均長(zhǎng)度為163.7±10.7nm,平均寬度為71.1±6.6nm。其它型別的假病毒大小與VSV A G-luc-HTNV.相似。 5.用抗?jié)h灘型漢坦病毒的單克隆抗體(即抗Gc特異性單克隆抗體HCO2和11E10),抗VSV單克隆抗體mAb VSV,及SNV, ANDV和HTNV抗血清,分別與對(duì)應(yīng)的漢坦病毒假病毒和原型分離株漢坦病毒反應(yīng),同一種抗體對(duì)兩種病毒表現(xiàn)出相似的抑制效果。 6.抗SNV血清可以中和嵌合假病毒,對(duì)兩個(gè)嵌合的假病毒的中和作用介于抗SNV和PHV假病毒之間。另外抗SNV血清對(duì)PHVMSNV中和作用比SNVMPHV稍強(qiáng)。 7. ReoPro可以同時(shí)減少致病性漢坦病毒和相對(duì)應(yīng)的漢坦病毒假病毒進(jìn)入Vero-E6細(xì)胞,紫外滅活的SNV和HTNV可以分別抑制SNV和HTNV假病毒進(jìn)入細(xì)胞。 8.阿比朵爾可以特異性抑制漢坦病毒假病毒進(jìn)入細(xì)胞。可以用流式細(xì)胞儀對(duì)HV004假病毒感染細(xì)胞后進(jìn)行檢測(cè),從而有望用于高通量藥物篩選。 結(jié)論： 1.湖北HFRS疫區(qū)流行一種新亞型HTNV,其很有可能是引起近年來(lái)HFRS流行的病原體。 2.漢坦病毒假病毒在抗原特征以及進(jìn)入細(xì)胞方式上與原型分離株病毒相似,這為進(jìn)一步研究漢坦病毒包膜蛋白與細(xì)胞的相互作用、病毒趨向性的研究以及應(yīng)用于抗?jié)h坦病毒藥物的篩選提供了新的手段。
[Abstract]:Objective:
The study of hantavirus gene characteristics in Hubei area in recent years, and the construction of different hantavirus pseudo virus, thus provide a new way to further study the function of hantavirus G protein.
Method錛，

本文編號(hào)：1998198