本文選題：P19EC + 細(xì)胞　； 參考：《湖南大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：干細(xì)胞（Stem cell，SC）是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。近年來干細(xì)胞領(lǐng)域的研究為疾病治療提供了嶄新思路，極大的推動(dòng)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。干細(xì)胞多能性維持與定向分化過程涉及特定基因表達(dá)的開啟與關(guān)閉，依賴于復(fù)雜而精細(xì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文以P19EC細(xì)胞為體系，對(duì)干細(xì)胞多能性關(guān)鍵基因OCT4在干細(xì)胞分化早期的抑制表達(dá)機(jī)理作了初步探索。 轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3（Groucho-related gene3）屬于Groucho輔助抑制因子（corepressor）家族，在胚胎發(fā)育及器官形成等生理過程中發(fā)揮重要作用。以往的研究表明，由于蛋白序列中不具備DNA結(jié)合域，轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3通常被能結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子招募至靶基因的調(diào)控區(qū)域，進(jìn)而可能通過改變?nèi)旧|(zhì)修飾狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制功能。本文中使用多種手段考察了Grg3參與多能性基因OCT4轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制。Grg3表達(dá)水平在P19細(xì)胞受維甲酸誘導(dǎo)向神經(jīng)分化的過程中維持不變，，通過運(yùn)用Grg3特異性siRNA以及外源Grg3-V5融合蛋白高表達(dá)質(zhì)粒工具，我們發(fā)現(xiàn)P19EC細(xì)胞中OCT4表達(dá)水平受到Grg3蛋白水平變化的調(diào)節(jié)，高水平的Grg3抑制OCT4表達(dá)，干擾Grg3則使OCT4表達(dá)水平上升。進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Grg3對(duì)OCT4的表達(dá)抑制是通過特異性結(jié)合在OCT4啟動(dòng)子－3500bp~－3345bp區(qū)域來實(shí)現(xiàn)的。 轉(zhuǎn)錄因子FoxA1（Forkhead box A1）也叫HNF3α，屬于叉頭蛋白家族（Forkheadfamily）并參與調(diào)節(jié)眾多生理過程。研究表明FoxA1是P19向神經(jīng)分化早期的關(guān)鍵因子，且在體外已被證明與Grg3存在蛋白-蛋白相互作用，本文中也通過免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)在胞內(nèi)證實(shí)了這一點(diǎn)。OCT4啟動(dòng)子－3500bp~－3345bp區(qū)域包含2個(gè)FoxA1結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，這2個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變將使Grg3對(duì)該啟動(dòng)子區(qū)域活性的抑制作用消失。因此，F(xiàn)oxA1可能是OCT4轉(zhuǎn)錄抑制中招募Grg3的關(guān)鍵因子。
[Abstract]:Stem cell sci (stem cell sci) is a group of cells with self-renewal and multi-differentiation potential. In recent years, stem cell research has provided new ideas for disease treatment and greatly promoted the development of basic medicine. Pluripotent maintenance and directional differentiation of stem cells involve the opening and closing of specific gene expression and rely on complex and delicate transcriptional regulatory networks. In this paper, the mechanism of inhibition and expression of OCT4, a key gene for pluripotency of stem cells, was studied in P19EC cells at the early stage of stem cell differentiation. Grg3 cocho-related gene belongs to the Groucho corepressor-family. Play an important role in embryonic development and organ formation and other physiological processes. Previous studies have shown that due to the absence of DNA binding domains in protein sequences, transcription co-suppressor Grg3 is usually recruited to target gene regulatory regions by transcription factors that bind to DNA. In turn, transcriptional inhibition may be achieved by changing the chromatin modification state. In this study, we investigated the mechanism of Grg3 involved in the transcription inhibition of multipotent gene OCT4. The expression level of Grg3 remained unchanged in the process of P19 cell differentiation induced by retinoic acid. By using Grg3 specific siRNA and high expression plasmid tools of exogenous Grg3-V5 fusion protein, we found that the expression of OCT4 in P19EC cells was regulated by the change of Grg3 protein level. High level of Grg3 inhibited OCT4 expression, and interference of Grg3 increased OCT4 expression. The further double luciferase reporter gene experiment and chip experiment confirmed that the inhibition of OCT4 expression by Grg3 was achieved by specifically binding in the region of OCT4 promoter -3500bpn-3345bp. The transcription factor FoxA1 (Forkhead box A1), also called HNF3 偽, belongs to Forkheadyfamilyfamily family). And involved in the regulation of many physiological processes. It has been shown that FoxA1 is a key factor in the early stage of P19 neural differentiation and has been proved to have protein-protein interaction with Grg3 in vitro. It was also confirmed by immunofluorescence co-localization assay that the region of .OCT4 promoter -3500bpf-3345bp contained two FoxA1 binding sites. The results of double luciferase reporter gene experiment showed that the OCT4 promoter contained two FoxA1 binding sites. The point mutation of these two loci will make Grg3 lose its inhibitory effect on the activity of the promoter region. Therefore, FoxA1 may be a key factor in recruitment of Grg3 in OCT4 transcription inhibition.
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：1986182