本文選題：內(nèi)皮祖細胞 + 鑒定�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：體外誘導(dǎo)分化內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs），然后應(yīng)用大自噬激活劑雷帕霉素、大自噬抑制劑3-MA（3-甲基腺嘌呤）干預(yù)，探討干預(yù)后的EPCs中大自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬生物學(xué)特性的變化，為下肢深靜脈血栓等疾病的治療提供一種新的思路和實驗依據(jù)。 方法：1. Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠的骨髓單個核細胞（bonemarrow-derived mononuclear cells，BMMNCs），內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基（EGM-2MV）體外誘導(dǎo)分化為EPCs并進行鑒定。觀察細胞形態(tài)學(xué)、增殖活性、內(nèi)皮細胞系列標志VEGFR-2、vwF免疫組化，祖細胞標志CD133、CD34免疫熒光技術(shù)動態(tài)鑒定。利用三維培養(yǎng)實驗鑒定EPC是否具有形成血管功能。 2.將貼壁EPCs細胞隨機分成2組,一組為雷帕霉素組，包括對照組(正常培養(yǎng)組)及雷帕霉素六個濃度組1μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L的EGM-2MV培養(yǎng)基中。另一組為3-MA組，包括對照組及3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine3-MA）六個濃度組，分別為1.25mmol/l、2.5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、20mmol/l、40mmol/l。各組分別培養(yǎng)24h。2.1采用常規(guī)四氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium MTT）比色法測定各濃度3-MA組、雷帕霉素組及對照組對EPCs增殖的作用。2.2利用Westernblot檢測LC3-Ⅱ、LAMP2A蛋白表達的變化。2.3利用免疫熒光方法分析LAMP2A蛋白熒光強度變化。 結(jié)果：1.新分離的骨髓單個核細胞(BMMNCs)呈圓形，大小不一，第3天左右大部分細胞開始貼壁，形態(tài)有梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形，第5-8天左右出現(xiàn)細胞集落和細胞線狀排列，第8-12天接近融合，呈典型鵝卵石樣外觀。細胞生長曲線呈，“S”形，EPCs在培養(yǎng)的6~11天增殖較快，，11天后進入平臺期，生長曲線呈典型“s’’形外觀。貼壁細胞的CD34、VEGFR、vWF、CD133均表達陽性。早期EPCs細胞增殖明顯，但未形成管腔樣結(jié)構(gòu)。晚期EPCs增殖明顯，形成網(wǎng)狀連接的管腔樣結(jié)構(gòu)。 2.經(jīng)雷帕霉素作用后測定的OD值呈明顯降低的趨勢，對照組明顯高于干預(yù)組（P0.05）。3-MA1.25mmol/l，2.5mmol/l對于EPCs作用24及48小時后細胞增殖和對照組相比無明顯影響，5mmol/l對于EPCs的增殖有明顯的促進作用，10mmol/l,20mmol/l，40mmol/l3-MA和對照組相比明顯抑制EPCs增殖（P0.05）。 Westernblot檢測各組目的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素組LC3-Ⅱ蛋白在1-5ug/l范圍內(nèi)表達明顯升高的趨勢，干預(yù)組明顯高于對照組（P0.05），在10-40ug/l范圍內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，其中10ug/l、20ug/l給藥組高于對照組（P0.05），40ug/l給藥組低于對照組（P0.05）。LMAP2A蛋白表達隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，干預(yù)組蛋白表達明顯低于對照組（P0.05）。3MA組作用EPCs24小時后LAMP2A蛋白在1-10mmol/l范圍內(nèi)隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞增表達，干預(yù)組蛋白表達明顯高于對照組（P0.01），在20-40mmol/l范圍內(nèi)LAMP2A蛋白隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，干預(yù)組蛋白表達高于對照組（P0.01）。LC3-Ⅱ蛋白表達隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，干預(yù)組蛋白表達明顯低于對照組（P0.05）。 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)雷帕霉素組LAMP2A表達的平均光密度值跟對照組相比呈逐漸下降趨勢（P0.05）。3MA組LAMP2A表達的平均光密度值在1.25-10mmol/l范圍內(nèi)跟對照組相比呈逐漸上升趨勢，在10-40mmol/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，但跟對照組相比無顯著意義（P0.05）。 結(jié)論：說明內(nèi)皮祖細胞的大自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬之間存在一定的功能互補的作用關(guān)系。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of large autophagy and molecular mate - mediated autophagy on endothelial progenitor cells ( EPCs ) in vitro and to provide a new and experimental basis for the treatment of deep venous thrombosis of lower extremities .

Method : 1 . Bone marrow mononuclear cells ( BMMNCs ) and endothelial progenitor cell culture medium ( EGM - 2MV ) were induced and differentiated into EPCs and identified by Ficoll density gradient centrifugation .

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本文編號：1918413