本文選題：生長板 + 組織工程�。� 參考：《華中科技大學》2011年博士論文

【摘要】：目的： 1.研究大鼠骺板軟骨細胞及前軟骨干細胞(PSCs)接種殼聚糖/藻酸鹽復合多孔支架體外三維培養(yǎng),探討其構建組織工程化骺板的可行性。 2.研究動態(tài)壓應力對體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞外基質以及甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP) mRNA表達的影響。 3.研究動態(tài)壓應力對體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞Sox9 mRNA及蛋白表達水平的影響,并初步探討其力學信號轉導機制。 4.研究動態(tài)張應力對體外培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細胞甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)表達的影響,并初步探討細胞骨架是否參與該力學信號轉導過程。 方法： 1.冷凍干燥法制備殼聚糖/藻酸鹽復合三維多孔支架；機械分離與酶消化相結合分離骺板軟骨細胞；免疫磁珠分選前軟骨干細胞(PSCs),誘導其向軟骨細胞特性方向分化；細胞接種支架體外三維培養(yǎng),掃描電鏡觀察細胞粘附、增殖,MTT評估細胞增殖狀況,RT-PCR檢測成軟骨分化指標,阿辛藍法測定細胞蛋白多糖(GAG)的合成情況。 2.分離并體外培養(yǎng)大鼠骺板軟骨細胞,用自行設計制作的可控細胞壓力加載裝置對細胞進行不同強度和持續(xù)時間的壓應力刺激,采用RT-PCR技術分別檢測各組軟骨特性細胞外基質(Ⅱ型膠原、X型膠原以及aggrecan)以及PTHrP mRNA表達并進行半定量分析。 3.大鼠骺板軟骨細胞分組予以動態(tài)壓應力和鈣離子拮抗劑硝苯地平作用24小時。實時定量PCR及Western blot檢測分析各組細胞的Sox9 mRNA及蛋白表達情況；細胞行Fluo-3/AM染色,激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀測胞內(nèi)鈣離子熒光強度。 4.免疫磁珠分選骺板前肥大/肥大層軟骨細胞,細胞予以不同強度(3%、6%、12%形變)的動態(tài)張應力(1Hz)刺激作用24小時,實時定量PCR和Western blot檢測各組細胞的PTHrP mRNA和蛋白的表達情況；流式細胞技術檢測細胞周期變化。細胞予以一定的張應力刺激和細胞骨架松弛素D (2μM), FITC標記的鬼筆環(huán)肽行細胞骨架微絲(F-actin)染色,激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)觀測各組細胞骨架形態(tài)變化。 結果： 1.采用冷凍干燥法制備的殼聚糖/藻酸鹽復合三維多孔支架具有較好的孔徑及孔隙率；PSCs體外培養(yǎng)增殖迅速,誘導后的PSCsⅡ型膠原免疫細胞染色及甲苯胺蘭、番紅O染色陽性；骺板軟骨細胞和誘導后的PSCs接種支架后生長良好并分泌細胞外基質,Sox9、Ⅱ型膠原均陽性表達,培養(yǎng)14天后培養(yǎng)液GAG含量兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.骺板軟骨細胞在30 mmHg、60 mmHg、90 mmHg動態(tài)壓力培養(yǎng)環(huán)境下生長良好,各時間點PTHrP、Ⅱ型膠原以及aggrecan mRNA表達水平高于對照組(P0.05)；X型膠原表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.骺板軟骨細胞在90mmHg(12kPa)動態(tài)壓應力下培養(yǎng)24小時后,實時定量PCR結果顯示單純壓應力組其Sox9 mRNA及蛋白表達水平明顯高于未受力的對照組(P0.05)；添加硝苯地平的壓應力組其Sox9表達水平亦高于對照組(P0.05),但低于單純壓應力組(P0.05).LSCM結果顯示各組胞內(nèi)鈣離子平均熒光強度差異無統(tǒng)計學意義。 4.動態(tài)張應力對骺板前肥大/肥大軟骨細胞PTHrP表達的影響呈劑量和時間依賴性,高強度(12%形變)的張應力增加細胞死亡率。強度為6%形變的動態(tài)張應力(1Hz)作用24小時明顯上調PTHrP表達,LSCM結果顯示細胞F-actin在受力后發(fā)生重構。細胞骨架松弛素D能部分阻斷應力所致的細胞PTHrP表達的上調。 結論： 1. PSCs誘導后向軟骨細胞功能方向分化,與殼聚糖/藻酸鹽三維多孔支架復合有望用于骺板損傷修復。 2.適當?shù)膭討B(tài)壓應力能有效促進體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞Ⅱ型膠原及aggrecan mRNA表達,PTHrP在此細胞力學信號響應過程中可能起重要作用。 3.適當?shù)膭討B(tài)壓應力能促進體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細胞Sox9 mRNA及蛋白的表達,細胞鈣離子通道可能參與該力學信號轉導過程。 4.動態(tài)張應力能影響體外培養(yǎng)的大鼠骺板前肥大/肥大軟骨細胞PTHrP mRNA和蛋白的表達水平,細胞骨架參與該力學信號轉導過程。
[Abstract]:Objective:
1. the chondrocytes of the epiphyseal plate and the anterior chondrocytes (PSCs) were inoculated with chitosan / alginate composite porous scaffold in vitro, and the feasibility of constructing the tissue engineered epiphyseal plate was investigated.
2. to study the effect of dynamic compressive stress on the extracellular matrix and the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP) mRNA in epiphyseal plate of rats.
3. to study the effect of dynamic compressive stress on the expression of Sox9 mRNA and protein in rat epiphyseal plate chondrocytes in vitro, and to preliminarily explore the mechanism of mechanical signal transduction.
4. the effects of dynamic tensile stress on the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP) in the cultured rat growth plate chondrocytes were investigated, and whether the cytoskeleton was involved in the mechanical signal transduction process was preliminarily investigated.
Method錛，

本文編號：1917081