本文選題：亞細(xì)胞定位 + 轉(zhuǎn)激活　； 參考：《蘇州大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：由于ZBTB家族成員主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過(guò)BTB結(jié)構(gòu)域和ZNF結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白與蛋白之間的互作及蛋白與特異性堿基序列的結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞周期等重要的生理功能。目前關(guān)于ZBTB8A功能研究的報(bào)道很少，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查閱人ZBTB8A相關(guān)信息設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，通過(guò)RT-PCR從胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中克隆到人ZBTB8A基因，，測(cè)序證實(shí)其為目的基因，構(gòu)建ZBTB8A全長(zhǎng)及其截短的不同重組質(zhì)粒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 使用ZBTB8A全長(zhǎng)及其截短的GFP融合表達(dá)載體來(lái)探索其在亞細(xì)胞水平上的分布情況，亞細(xì)胞定位顯示：GFP呈全細(xì)胞分布；GFP-ZBTB8A融合蛋白位于細(xì)胞核且呈斑點(diǎn)狀分布；GFP-ZBTB8A-BTB融合蛋白顯示核周斑點(diǎn)狀分布，GFP-ZBTB8A-ZNF融合蛋白呈細(xì)胞核均勻分布。這些結(jié)果表明，ZBTB8A蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子存在于核內(nèi)，其中這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在斑點(diǎn)狀分布中均起著重要的作用，這可能與它們自身結(jié)構(gòu)域的功能相關(guān)。 為了探討ZBTB8A可能參與調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)通路，采用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)ZBTB8A對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示：ZBTB8A蛋白抑制多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路活性，特別對(duì)pCRE-Luc具有顯著的抑制效應(yīng)并表現(xiàn)為劑量依賴性。這說(shuō)明ZBTB8A蛋白在某些功能方面可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路活性的調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和細(xì)胞周期等重要的生理過(guò)程。 將原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-ZBTB8A轉(zhuǎn)化到BL21宿主菌，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，加入終濃度為0.6mM IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)，將誘導(dǎo)的菌體裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，浸泡于0.25M KCl溶液，切下乳白色的目的條帶并切碎，電洗脫和透析，獲得GST-ZBTB8A融合蛋白，免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)所純化的蛋白為目的蛋白（抗GST標(biāo)簽抗體），BCA法測(cè)定其濃度為1.254mg/mL，用純化的蛋白多次免疫兔子，獲得相應(yīng)的免疫血清。 應(yīng)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫血清進(jìn)行特異性分析，實(shí)驗(yàn)表明：免疫血清中既含抗ZBTB8A蛋白的抗體又含抗GST標(biāo)簽的抗體；ZBTB8A蛋白中的BTB結(jié)構(gòu)域和ZNF結(jié)構(gòu)域均為抗原決定簇即多克隆抗體中含抗這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗體；多克隆抗體可用于內(nèi)源性表達(dá)ZBTB8A蛋白的檢測(cè)。通過(guò)瓊脂糖雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定其效價(jià)為1:32；使用ProteinG純化免疫血清，SDS-PAGE檢測(cè)其純化效果，獲得相對(duì)較純的抗體，為進(jìn)一步的研究提供一定的支持。
[Abstract]:Because the members of the ZBTB family are mainly transcriptional regulators, the transcriptional activity of the gene is regulated by the interaction between protein and protein mediated by BTB domain and ZNF domain and the binding between protein and specific base sequence. And then affect cell proliferation, differentiation, migration, apoptosis and cell cycle and other important physiological functions. At present, there are few reports on the functional study of ZBTB8A. According to the relevant information of human ZBTB8A from NCBI database, the corresponding primers were designed and cloned from the gastric cancer cell line AGS by RT-PCR, and the target gene was confirmed by sequencing. The full length and truncated recombinant plasmids of ZBTB8A were constructed to prepare for further experiments. The full length of ZBTB8A and its truncated GFP fusion expression vector were used to explore its distribution at subcellular level. The subcellular localization showed that the GFP-ZBTB8A fusion protein was located in the nucleus and the GFP-ZBTB8A-BTB fusion protein showed that the GFP-ZBTB8A-ZNF fusion protein was evenly distributed in the nucleus. These results suggest that the ZBTB8A protein is a transcription factor in the nucleus, in which the two domains play an important role in the dot-like distribution, which may be related to the function of their own domain. In order to explore the cellular signaling pathway in which ZBTB8A may be involved, double luciferase detection kit was used to detect the transcriptional regulation of ZBTB8A on the related signal pathway. Double luciferase assay showed that the protein of 1% ZBTB8A inhibited the activity of many cell signaling pathways, especially in a dose-dependent manner. These results suggest that ZBTB8A may play a role as a transcription suppressor in regulating the activity of multiple cell signaling pathways, and thus affect cell proliferation, differentiation, apoptosis, migration, cell cycle and other important physiological processes. The prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-ZBTB8A was transformed into BL21 host strain. When the cell grew to logarithmic stage, the final concentration of 0.6mM IPTG was added for 5 hours. After SDS-PAGE electrophoresis, the induced lytic liquid was immersed in 0.25 M KCl solution, and the target band of milky white was cut and shredded. The GST-ZBTB8A fusion protein was obtained by electroelution and dialysis. The purified protein was further confirmed by Western blot as the target protein (the concentration of the purified protein was 1.254 mg / mL determined by anti-BCA labeled antibody). Rabbits were immunized with the purified protein several times to obtain the corresponding immune serum. Immunoblotting assay was used to analyze the specificity of immune serum. The results showed that the BTB domain and ZNF domain of ZBTB8A protein contained both anti-ZBTB8A protein and anti-ZBTB8A antibody, which were antigenic determinants, that is, polyclonal antibodies contained antibodies to these two domains. Polyclonal antibodies can be used for the detection of endogenous expression of ZBTB8A protein. The titer was 1: 32 by agarose double diffusion assay, and the purified antibody was obtained by using ProteinG purified immune serum and SDS-PAGE, which provided some support for further research.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1887331