本文選題：β1腎上腺素受體 + 自身抗體�。� 參考：《山西醫(yī)科大學》2011年博士論文

【摘要】：研究背景 神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)是機體重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng),三者之間相互協(xié)調(diào)、相互平衡,從而維持機體功能的穩(wěn)態(tài)。當這種平衡被各種理化因素破壞時,會導致病理過程的出現(xiàn)和/或某些疾病的發(fā)生。 交感神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,在維持機體功能穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在生理情況下,交感神經(jīng)激活后,其末梢釋放的兒茶酚胺類物質(zhì),通過與分布在靶器官上的腎上腺素受體結(jié)合,來調(diào)節(jié)各種靶器官的功能活動。有大量研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類物質(zhì)的異常釋放與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而,在某些病理情況下,機體表現(xiàn)出交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活的現(xiàn)象并不能完全用兒茶酚胺類物質(zhì)大量釋放來解釋,提示可能還有其他未知因素的參與。 上世紀九十年代以來,諸多研究人員在擴張型心肌病、原發(fā)性電紊亂以及chagas病等多種心血管疾病患者血清中發(fā)現(xiàn)有類兒茶酚胺的物質(zhì),進一步的研究發(fā)現(xiàn),這種物質(zhì)是針對β1-AR細胞外第二環(huán)(the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AR-ECII)的自身抗體,即β1-AA(Autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor),它可以與β1-AR-ECII結(jié)合發(fā)揮類激動劑樣的作用,提示β1-AA可能與交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活有關(guān)。 以往人們對β1-AA的研究只局限于其對心血管系統(tǒng)的影響,隨著神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)學的發(fā)展,這種自身抗體對機體的影響有待重新審視。已有研究發(fā)現(xiàn),β-AR的激動劑異丙腎上腺素(ISO)可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。我們的前期研究用主動免疫的方法誘導大鼠產(chǎn)生β1-AA,即用人β1-AR-ECII (人鼠同源性為100%)主動免疫Wistar大鼠18個月后,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯障礙的同時,反映大鼠T淋巴細胞活性狀態(tài)的外周血CD4+/CD8+淋巴細胞比值也升高,提示β1-AA的長期存在可能會導致機體的免疫功能發(fā)生改變。但是,主動免疫過程是將抗原肽段注入大鼠體內(nèi),在此過程中抗原肽段本身可能會導致機體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生改變,因此該研究還不能得出β1-AA長期存在可以直接導致免疫系統(tǒng)發(fā)生改變的結(jié)論;另外,由于在此過程中,動物體內(nèi)產(chǎn)生的β1-AA遠高于臨床患者血清中該抗體的水平,因而用主動免疫模型的研究結(jié)果來解釋臨床也并不合理。因此,我們需要建立血清中β1-AA濃度接近臨床實際情況的動物模型,進一步觀察β1-AA長期存在對機體免疫系統(tǒng)功能的影響。 眾所周知T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)中功能最重要的一類細胞群,而T淋巴細胞的增殖是其發(fā)揮多種生物學功能的前提。已有研究報道,兒茶酚胺類物質(zhì)可以通過β1-AR-cAMP-PKA、β2-AR-cAMP-PKA、β1/β2-AR-PKC以及Ca~(2+)途徑來調(diào)節(jié)靶細胞的功能活動。而在大鼠的T淋巴細胞表面存在的β-AR亞型主要是β2-AR,其表面幾乎不存在β1-AR,那么,該自身抗體對大鼠T淋巴細胞的增殖是否有影響?如果有,是通過何種途徑來實現(xiàn)的?Ca~(2+)又在其中扮演何種角色? 決定T淋巴細胞功能特征的關(guān)鍵因素是它們所分泌的細胞因子種類。其中IL-2和IFN-γ是由Th1細胞合成和分泌的,反映機體細胞免疫功能;而IL-4是由Th2合成和分泌,介導體液免疫。因此我們在本研究中檢測這些細胞因子的分泌水平來反映機體的免疫功能狀態(tài)。 目前研究報道,在人的T淋巴細胞上可同時表達有β1-AR、β2-AR以及β3-AR。鑒于在大鼠的T淋巴細胞表面幾乎不表達β1-AR,所以我們不能完全用以上動物實驗結(jié)果來反映β1-AA對臨床患者免疫系統(tǒng)的影響。因此,我們選用人外周血T淋巴細胞,觀察β1-AA對人外周血T淋巴細胞增殖和分泌的影響?并進一步分析其途徑。 綜上所述,本課題的研究目的(1)建立與臨床患者血清中β1-AA滴度相匹配的β1-AA被動免疫大鼠模型,觀察β1-AA長期存在對機體免疫功能是否有影響?(2)以免疫磁珠分選的大鼠脾臟T淋巴細胞為研究對象,研究β1-AA對大鼠T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響?(3)以免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細胞為研究對象,研究β1-AA對人T淋巴細胞的增殖和分泌功能的影響,同時探索其作用途徑如何? 第一部分β1-AA長期存可以導致大鼠免疫系統(tǒng)功能改變 研究目的 建立與臨床患者血清中β1-AA水平相匹配的β1-AA被動免疫大鼠模型,觀察β1-AA長期存在對機體免疫功能的影響。 材料和方法 1.實驗動物 健康雄性Wistar大鼠,8周齡,體重180-200g。 2.實驗方法 2.1抗原肽段的合成 根據(jù)人β1腎上腺素受體細胞外第二環(huán)的氨基酸序列(β1-AR-ECII)(197aa-223aa,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y -N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A),由吉爾生化上海有限公司合成抗原肽段,純度95%。 2.2獲取β1-AA 選用健康的8周齡雄性Wistar大鼠作為免疫對象,隨機分為兩組: ①β1-AR-ECII肽段組即免疫組(n=40):將抗原和免疫佐劑的混合物按0.4μg/g劑量注入動物背部皮下,每兩周加強免疫一次,共免疫8周。 ②溶劑對照組即偽免疫組(n=40):將生理鹽水和免疫佐劑的混合物以一定比例注入動物背部皮內(nèi),每兩周加強免疫一次,共免疫8周。 用SA-ELISA (Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay)方法檢測血清中β1-AA的水平。利用MAb Trap Kit試劑盒對免疫組陽性血清中的β1-AA及偽免疫組陰性血清中的IgG進行提取和純化。純化后的抗體蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠凝膠電泳檢測其純度,使用BCA試劑盒進行蛋白定量。 2.3大鼠被動免疫 β1-AA組:將提純后的β1-AA IgGs按2μg/g體重劑量經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi),每2周加強免疫一次,共免疫20周; 偽免疫組:將從β1-AA陰性的血清中提純的IgGs注射到大鼠體內(nèi),免疫方法和劑量同前一組。 2.4大鼠在體心功能檢測 建立被動免疫模型后,定期(0w、4w、8w、12w、16w、20w)監(jiān)測大鼠的心功能。每組隨機抽取5只大鼠,氨基甲酸乙酯(20%,1g/kg)腹腔麻醉后,經(jīng)右頸總動脈小心插向左心室,以出現(xiàn)特征性左心室壓力波為插入標志后,固定導管,打開動脈夾。用BL-410生物信號記錄分析系統(tǒng)檢測并記錄各心功能參數(shù):左心室收縮壓(Left Ventricular Systolic Pressure,LVSP)、左心室舒張末期壓(Left Ventricular End-Diastolic Pressure,LVEDP)、左心室壓力上升的最大速率(+dp/dt_(max))和左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt_(max))。 2.5大鼠脾臟淋巴細胞分離 大鼠麻醉,無菌取出大鼠脾臟;用注射器內(nèi)芯研磨脾臟,過200目篩網(wǎng),獲取單細胞懸液;低滲破壞紅細胞后,獲取脾臟淋巴細胞。 2.6流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血CD4+/CD8+ T淋巴細胞比值測定 取100μL外周血(1×10~6個/mL),按試劑說明書分別加入FITC標記的CD4抗體與PE標記的CD8抗體,同時另設(shè)管標記FITC或PE熒光標記的單克隆大鼠IgG1抗體作為陰性對照,避光室溫作用20min;用PBS溶液,洗細胞3次;200μL PBS溶液重懸細胞,上流式細胞儀獲取10,000個細胞,先以陰性對照測出本底參數(shù),再進行樣本測定,計算機讀出測定值。以T淋巴細胞CD4~+/CD8~+值評估機體免疫狀態(tài)。 2.7被動免疫大鼠B淋巴細胞抗體生成能力測定 用20%綿羊紅細胞(SRBC)生理鹽水懸液腹腔免疫大鼠,4天后無菌取出脾臟,用PBS洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用無菌注射器針芯研磨成懸液,PBS洗滌兩次,用RPMI1640調(diào)整細胞數(shù)為5×10~6/mL。按照Jerne和Nordin等改良的直接及間接溶血空斑實驗測定B淋巴細胞抗體生成能力�？瞻邤�(shù)量采用VilBer Lourmat capt軟件測定。 2.8大鼠心臟、肝臟、腎臟組織石蠟切片的HE染色 將石蠟切片用二甲苯脫蠟;經(jīng)各級乙醇梯度脫水后蒸餾水洗;蘇木素染色5min,伊紅染色2min;常規(guī)脫水,透明,封片,光鏡下觀察心臟、肝臟、腎臟的組織病理切片。 結(jié)果 1通過主動免疫大鼠成功獲取β1-AA 1.1主動免疫大鼠模型建立成功 大鼠在第一次免疫后2周,與偽免疫組相比,β1-AR-ECII肽段免疫組血清中β1-AA的OD值已由0.73±0.06升高到0.41±0.05(P0.05);到8周時免疫組血清中的β1-AA的OD值達到3.02±0.09,遠高于偽免疫組0.40±0.02(P0.01),(圖1-1)。本結(jié)果提示主動免疫模型建立成功。 1.2β1-AA蛋白定性及定量測定結(jié)果 用親和柱純化β1-AA,純化后的β1-AA經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測純度,結(jié)果有兩條帶出現(xiàn)(圖1-2),分別是IgG重鏈(55KD)和輕鏈(25KD),此條帶與IgG標準品相一致,表明純化效果理想。 純化后的β1-AA經(jīng)BCA試劑盒測定:蛋白濃度為8mg/mL。 2β1-AA被動免疫大鼠模型建立成功 2.1被動免疫過程中大鼠體內(nèi)β1-AA水平維持在一定水平 在被動免疫前,大鼠血清中β1-AA的OD值為0.08±0.030,到被動免疫第4周時,血清中β1-AA的OD值達到0.22±0.029,明顯高于偽免疫組的OD值0.09±0.040(P0.001)。隨著被動免疫時間的延長,免疫組大鼠血清中的β1-AA水平可以維持在一定水平,并且與偽免疫組相比,都有明顯統(tǒng)計學差異(P0.001,圖1-3)。 2.2β1-AA被動免疫大鼠在體心功能的變化 在被動免疫后8周,與偽免疫組相比,免疫組大鼠的左室收縮壓(LVSP)和室內(nèi)壓上升的最大速率(+dp/dt_(max))(反映左室收縮功能的指標)明顯升高,而反映左室舒張功能的指標左室舒張末壓(LVEDP)和室內(nèi)壓下降的最大速率(-dp/dt_(max))沒有明顯變化(P0.05)。到被動免疫第20周時,與偽免疫組相比,免疫組大鼠的LVSP明顯下降、+dp/dt_(max)明顯下降、LVEDP明顯升高、-dp/dt_(max)明顯下降。(圖1-4A,B,C,D)提示:隨著被動免疫時間的延長,免疫組大鼠心功能出現(xiàn)了明顯下降。 3β1-AA長期存在導致大鼠機體免疫功能發(fā)生改變 3.1β1-AA長期存在可以導致大鼠外周血CD4~+/CD8~+T淋巴細胞比值增加 在被動免疫4周時,β1-AA免疫組的CD4~+/CD8~+T細胞比值開始升高,但與偽免疫組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05);到免疫第8周時,β1-AA免疫組的CD4~+/CD8~+比值由偽免疫組的2.00±0.45升高到免疫組2.92±0.39(P0.05),并且在被動免疫8周以后,這種增高趨勢仍然持續(xù),到被動免疫20周時,免疫組CD4~+/CD8~+比值升高到3.49±0.42,遠高于偽免疫組1.89±0.40(P0.01)(圖1-5)。 結(jié)果提示,β1-AA在體內(nèi)長期存在,可以導致機體的細胞免疫功能發(fā)生改變。 3.2β1-AA長期存在可以使大鼠B淋巴細胞抗體生成能力增強 本研究采用直接及間接溶血空斑實驗來測定β1-AA長期存在大鼠B淋巴細胞的功能(即抗體生成能力)來反映機體的體液免疫功能。結(jié)果顯示,在免疫第8周時,β1-AA被動免疫組大鼠直接溶血空斑數(shù)量和間接溶血空斑數(shù)量分別達到960±89,1527±84,與偽免疫組相比(810±67,1321±78),均有明顯增多(P0.05),并且在8周后溶血空斑數(shù)量呈持續(xù)增高趨勢,到20周時這種差異更為明顯(P0.01)(圖1-6A, B)。 以上結(jié)果提示,在β1-AA長期存在于體內(nèi),大鼠出現(xiàn)免疫系統(tǒng)抗體生成能力增強,即體液免疫功能增強。 3.3β1-AA長期存在可以導致大鼠心臟、肝臟、腎臟淋巴細胞浸潤 被動免疫20周時,大鼠心臟進行HE染色發(fā)現(xiàn):在β1-AA免疫組心肌細胞排列紊亂,并且在間質(zhì)有淋巴細胞浸潤;而偽免疫組心肌組織形態(tài)與間質(zhì)均未見異常(圖1-7);在免疫20周時,大鼠肝臟HE染色顯示:在肝竇周圍有大量淋巴細胞浸潤(圖1-8),對照組未發(fā)生明顯改變;同時,免疫組大鼠腎臟的腎小球和腎小管周圍也有大量淋巴細胞浸潤(圖1-9),而偽免疫組未見明顯改變。 小結(jié)一 1.用純化的β1-AA長期被動免疫可建立與臨床病人抗體水平匹配的動物模型。 2.β1-AA長期存在可引發(fā)機體的細胞免疫功能改變。 3.β1-AA長期存在可以使B淋巴細胞抗體生成能力增強。 第二部分β1-AA主要通過β2-AR途徑促進ConA激活的大鼠T淋巴細胞增殖和分泌功能 研究目的 1.以免疫磁珠分選的大鼠脾臟T淋巴細胞為研究對象,研究β1-AA對大鼠T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響。 2.觀察鈣離子在β1-AA促進大鼠T淋巴細胞增殖中的作用。 材料與方法 1.實驗對象 健康雄性Wistar大鼠。 2.實驗方法 2.1大鼠脾臟CD3~+T淋巴細胞分離 無菌取出大鼠脾臟;用注射器內(nèi)芯研磨脾臟,過200目篩網(wǎng),獲取單細胞懸液;低滲溶液破壞紅細胞后,獲取脾臟淋巴細胞;用免疫磁珠分選CD3~+的T淋巴細胞。采用流式細胞技術(shù)檢測分選的大鼠CD3~+T淋巴細胞的陽性率;采用Guava PCA CytoSoft6.0.2軟件的ViaCount模塊進行細胞活性測定。 2.2利用免疫熒光化學方法觀察β1-AR在大鼠T淋巴細胞上的表達 將純化分離的大鼠T淋巴細胞進行涂片,用4%的多聚甲醛室溫固定20min后,PBS漂洗三次,用含10%胎牛血清的PBS室溫封閉2h;加入特異性一抗4℃孵育過夜;PBS漂洗3次,加入二抗37℃避光孵育半小時;去除二抗,加入DAPI染色液室溫作用15min以上,PBS沖洗三次,封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。 2.3實驗分組 2.3.1觀察β1-AA對分選的淋巴細胞的增殖的影響,分為以下2組: (1)溶劑對照組:分選的淋巴細胞加入生理鹽水; (2)β1-AA處理組:分選的淋巴細胞直接加入β1-AA。 2.3.2根據(jù)T淋巴細胞的活化特性,分為以下2組 (1)溶劑組對照:分選的T淋巴細胞加入生理鹽水; (2)ConA處理組:給予分選的T淋巴細胞5μg/mL ConA預刺激72h。將激活的T淋巴細胞懸液均勻接種于96孔細胞培養(yǎng)板(100μL/孔),每孔分別加入20μL各種干預因素: 2.3.3為了觀察β1-AA對ConA激活的T淋巴細胞是否有促增殖作用分為以下5組 (1)溶劑對照組:生理鹽水; (2)陰性對照:β1-AA陰性血清IgGs組(0.1μmol/L); (3)陽性對照組:不同濃度的β-AR激動劑異丙腎上腺素組(ISO,0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L); (4)不同濃度的β1-AA組(0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR抗原肽段組(3μmol/L); 2.3.4為了觀察不同干預對β1-AA對ConA激活的T淋巴細胞增殖的影響分為以下10組 (1)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β1-AA(0.1μmol/l)+β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1-AA(0.1μmol/l)+β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β1-AA(0.1μmol/l)+β-AR阻斷劑Propranolol組(1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)β1-AA(0.1μmol/l)+PKC抑制劑Chelerythrine Chloride(1μmol/L); (7)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L)+PKC抑制劑Chelerythrine Chloride(1μmol/L); (8)β1-AA(0.1μmol/l)+L-Ca通道阻斷劑維拉帕米(1μmol/l) (9)β1-AA(0.1μmol/l)+IP3受體阻斷劑肝素(1μmol/l) (10)β1-AA(0.1μmol/l)+鈣釋放活化的Ca2+通道(CRCA)阻斷劑SKF96365(1μmol/l) 2.3.5為了觀察單獨的阻斷劑對T淋巴細胞增殖的影響分為以下6組 (1)β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β-AR阻斷劑Bupranolol組(1μmol/L); (5)PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)PKC抑制劑Chelerythrine(1μmol/L); 2.4用CCK-8法檢測大鼠T淋巴細胞增殖 將上述加入各種干預的T淋巴細胞置5%CO_2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)48h,之后每孔加入10μL CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)2h后,由于生成的甲佨物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比,在酶標儀上于波長λ=450nm處讀取各孔的OD值,進行細胞增殖分析,以上各組重復8次。 2.5 ELISA法測定T淋巴細胞cAMP水平以及細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ及IL-4含量 將標準品和樣品100μL加入酶標板中,置37℃孵育60~90min;用洗板液充分洗板4次;每孔加酶標抗體工作液,置37℃孵育60~90min;用洗板液充分洗板4次;每孔加底物工作液,置37℃避光反應(yīng)15min;用洗板液充分洗板4次;每孔加終止液,混勻后即刻于酶標儀450nm波長處測量OD值。 2.6 T淋巴細胞胞漿中鈣離子水平的測定 采用前述方法分離的大鼠T淋巴細胞ConA刺激后,取細胞懸液,在避光條件下,加入鈣熒光指示劑Fluo-3/AM(3μmol/L)37℃孵育30min,之后用PBS液漂洗3次,每次5min,靜置10min。將負載了Fluo-3/AM指示劑的淋巴細胞懸液加入共聚焦專用皿中,采用激光掃描共聚焦掃描顯微鏡(Olympus,FV1000)進行觀察,熒光強度(F值)來表示胞漿中鈣離子水平。 結(jié)果 1大鼠脾臟CD3~+T淋巴細胞分選成功 首先將用免疫磁珠分選的大鼠CD3~+T淋巴細胞用抗FITC-CD3~+的抗體通過流式細胞儀進行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞占到92.2%(圖2-1);隨后,用Guava流式細胞分析儀進行細胞活性測定,分選后的活細胞95%,光鏡下細胞形態(tài)均一,提示T淋巴細胞分選成功(圖2-2,2-3)。 2大鼠T淋巴細胞表面無β1-AR的表達 為了進一步驗證在大鼠T淋巴細胞表面是否表達β1-AR,本研究利用免疫熒光化學技術(shù)發(fā)現(xiàn):DAPI染色的淋巴細胞的核呈蘭色,在陰性對照組(圖2-4A)和實驗組(圖2-4B)均沒有檢測到FITC標記二抗的綠色熒光。提示:在大鼠的脾臟T淋巴細胞表面沒有檢測到β1-AR的表達。 3β1-AA對免疫磁珠分選后未經(jīng)ConA激活的大鼠T淋巴細胞增殖沒有影響 由于用免疫磁珠分選的大鼠T淋巴細胞中,除了含有大量的T(90%-95%)外,含有少量的其他單核細胞,同樣為了檢測β1-AA對T細胞以及其他單核細胞是否有直接作用,我們將β1-AA直接加入免疫磁珠分選后的細胞,發(fā)現(xiàn):β1-AA對這些細胞的增殖沒有作用(P0.05)(圖2-5) 4 ConA可以促進大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖 免疫磁珠分選的大鼠T淋巴細胞中加入ConA后,OD值達到0.38±0.04,明顯高于未加ConA的對照組的0.18±0.05(P0.01),提示ConA可以激活大鼠T淋巴細胞(圖2-6)。 5β1-AA可以濃度依賴性的促進ConA激活的大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖 在ConA激活的T淋巴細胞中,分別加入0.01,0.1,1μM的β1-AA,結(jié)果發(fā)現(xiàn):OD值分別由原先的0.37±0.04,0.38±0.06,0.42±0.04升高到0.50±0.04,0.61±0.02,0.68±0.05( P0.01; P0.01; P0.01),提示β1-AA可濃度依賴性地促進T淋巴細胞增殖(見圖2-7)。從陰性血清中提取的IgGs不能促進T淋巴細胞的增殖;β1-AR細胞外第二環(huán)與該抗體進行預孵育,中和抗體后,該抗體促進T淋巴細胞的增殖作用消失(圖2-8)。 6β1-AA促進大鼠T淋巴細胞的增殖的途徑 為了進一步驗證β1-AA促進T淋巴細胞增殖是否可以通過β2-AR,本研究發(fā)現(xiàn):β1-AR阻斷劑Atenolol對β1-AA的促增殖作用沒有影響,但是可以被β2-AR阻斷劑ICI118,551、β1-AR和β2-AR的拮抗劑Nadolol以及非特異性的β-AR阻斷劑Bupranolol完全阻斷;單獨的Atenolol、ICI118,551、Nadolol以及Bupranolol對T淋巴細胞的增殖沒有作用(圖2-9A,B),這一結(jié)果提示β1-AA促進T淋巴細胞的增殖作用可以通過β2-AR。加入β1-AA后,大鼠脾臟T淋巴細胞胞漿中cAMP水平升高,但是β1-AR阻斷劑Atenolol對于cAMP的升高沒有影響,并且這種cAMP的升高可以被β2-AR阻斷劑ICI118,551、β1-AR和β2-AR的阻斷劑Nadolol完全阻斷(圖2-10);進一步的研究發(fā)現(xiàn),PKA的阻斷劑H-89以及PKC的抑制劑chelerythrine均只能部分阻斷β-AA誘導的T淋巴細胞的增殖;而PKA的抑制劑H-89和PKC的抑制劑chelerythrine共同作用,可以完全抑制β-AA誘導的T淋巴細胞的增殖(圖2-11)。 這一結(jié)果提示:β1-AA刺激大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖可能主要是通過β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC途徑。 7鈣離子在β1-AA促進T淋巴細胞增殖中的作用 7.1β1-AA可以促進ConA激活的大鼠脾臟T淋巴細胞胞內(nèi)鈣的明顯升高 在ConA刺激的大鼠脾臟T淋巴細胞中加入β1-AA后,胞內(nèi)的鈣離子的平均熒光強度F值由200±8.5升高到628±25(P0.01),并且,β1-AA升高胞內(nèi)鈣的作用可以基本被β2-AR受體阻斷劑ICI118,551完全阻斷(P0.05)(圖2-12,2-13)。 這一結(jié)果提示:β1-AA可以通過激活β2-AR使淋巴細胞中的胞內(nèi)鈣水平升高。 7.2阻斷胞漿中鈣離子的水平的升高可以不同程度抑制β1-AA誘導的T淋巴細胞的增殖 為進一步研究鈣離子在β1-AA促進ConA刺激T淋巴細胞增殖中的作用,本研究將ConA激活的T淋巴細胞分別用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜IP_3受體( IP3 R)阻斷劑肝素以及CRAC通道抑制劑SKF96365預處理后,發(fā)現(xiàn):β1-AA的促進T淋巴細胞增殖作用可以被部分抑制。(圖2-14) 8β1-AA可以促進大鼠T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高 β1-AA(0.01,0.1,1μM)可濃度依賴性地促進大鼠T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高(圖2-15A,2-16A,2-17A);這種細胞因子水平的升高不能被β1-AR阻斷劑Atenolol阻斷,可以被β2-AR受體阻斷劑ICI118,551以及β1-AR和β2-AR的阻斷劑Nadolol、β-AR的非特異性阻斷劑Bupranolol完全阻斷(圖2-15B,2-16B,2-17B)。 小結(jié)二 1.β1-AA可以通過β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC通路促進大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖。 2.β1-AA可以通過促進大鼠T淋巴細胞胞漿中鈣離子水平升高進而促進T淋巴細胞的增殖。 3.β1-AA可以促進大鼠T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4分泌增加。 第三部分β1-AA促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖和分泌功能 研究目的 以免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細胞為研究對象,研究β1-AA對人外周血T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響,同時探索其作用途徑。 材料與方法 1.實驗對象 健康成人外周血。 2.實驗方法 2.1人外周血CD3~+T淋巴細胞的分選 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞;并用免疫磁珠分選CD3~+ T淋巴細胞。 2.2實驗分組 2.2.1觀察β1-AA對分選的淋巴細胞增殖的影響 (1)溶劑對照組:分選的淋巴細胞加入溶劑生理鹽水; (2)β1-AA處理組:分選的淋巴細胞直接加入β1-AA。 2.2.2觀察β1-AA對分選的T淋巴細胞活化特性的影響 (1)溶劑對照組:分選的T淋巴細胞加入溶劑生理鹽水。 (2)ConA組:給予分選的T淋巴細胞5μg/mL ConA預刺激72h。將激活的T淋巴細胞懸液均勻接種于96孔細胞培養(yǎng)板(100μL/孔),每孔分別加入20μL各種干預因素: 2.2.3觀察β1-AA對ConA激活的T淋巴細胞是否有促增殖作用 (1)溶劑對照組:生理鹽水; (2)陰性對照:β1-AA陰性血清IgGs組(0.1μmol/L); (3)陽性對照組:不同濃度的β-AR激動劑異丙腎上腺素組(ISO,0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L); (4)不同濃度的β1-AA組(0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR抗原肽段組(3μmol/L); 2.2.4觀察不同干預對β1-AA對ConA激活的T淋巴細胞增殖的影響 (1)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β1-AA(0.1μmol/l)+β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1-AA(0.1μmol/l)+β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β1-AA(0.1μmol/l)+β-AR阻斷劑Propranolol組(1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)β1-AA(0.1μmol/l)+PKC抑制劑Chelerythrine Chloride(1μmol/L); (7)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L)+PKC抑制劑Chelerythrine(1μmol/L); 2.2.5觀察單獨的阻斷劑對T淋巴細胞增殖的影響 (1)β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β-AR阻斷劑Bupranolol組(1μmol/L); (5)PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)PKC抑制劑Chelerythrine(1μmol/L); 2.3 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法檢測人外周血T淋巴細胞的增殖 見第二部分 2.4采用ELISA試劑盒檢測T淋巴細胞cAMP水平以及細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、IL-4 含量 見第二部分 結(jié)果 1β1-AA對分選的無ConA刺激的人T淋巴細胞增殖無影響 由于用免疫磁珠分選的人T淋巴細胞中,除了含有大量的T(90%-95%)淋巴細胞外,還含有少量的其他單核細胞,為了檢測β1-AA對T淋巴細胞以及少量單核細胞是否有直接作用,我們將β1-AA直接加入免疫磁珠分選后的細胞,發(fā)現(xiàn):β1-AA對這些細胞的增殖沒有影響(P0.05)(圖3-1)。 2 ConA可以促進人外周血T淋巴細胞的增殖 免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細胞中加入ConA后,未加ConA的對照組的OD值由原先的0.13±0.04升高到0.38±0.06(P0.01)(圖3-2),提示ConA可以激活人外周血T淋巴細胞。 3β1-AA可以促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞增殖 3.1β1-AA可以濃度依賴性的促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖 我們分別將濃度為0.01μM,0.1μM,1μM的β1-AA加入ConA刺激的人外周血T淋巴細胞中,經(jīng)CCK-8法檢測,發(fā)現(xiàn)OD值分別由加入前的0.39±0.04,0.40±0.03,0.42±0.04,增加為0.47±0.05(P0.05),0.61±0.04 (P0.01)和0.67±0.05(P0.01)(見圖3-3),提示β1-AA可以濃度依賴性地促進ConA刺激的人外周血T淋巴細胞增殖。為了證實該抗體作用的特異性,本研究選用從陰性血清中提取的IgGs作為陰性對照作用于ConA刺激的T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)OD值0.38±0.04改變?yōu)?.40±0.01(P0.05),提示此種IgG不能促進ConA刺激T淋巴細胞的增殖;用合成的β1-AR-ECII與該抗體進行預孵育,將β1-AA中和后,OD值由單純加入自身抗體時的0.61±0.04變化為0.39±0.009,提示β1-AA促進T淋巴細胞的增殖作用消失(P0.01)(圖3-4)。 以上結(jié)果提示,β1-AA可以促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖。 3.2β1-AA促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞增殖的可能機制 4.2.1β1-AA促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖可以通過β1-AR-cAMP-PKA途徑 為了探討β1-AA對T淋巴細胞的增殖作用是否通過β1-AR-cAMP-PKA途徑,本研究進行了以下實驗。 將ConA激活的T淋巴細胞分別采用β1-AR阻斷劑Atenolol和β-AR阻斷劑Bupranolol預處理后,發(fā)現(xiàn)OD值由0.61±0.04分別變化為0.50±0.05(P0.05)和0.40±0.03(P0.01),提示β1-AA的促增殖作用不能被β1-AR的阻斷劑Atenolol完全阻斷,但可以被β-AR阻斷劑Bupranolol完全阻斷(圖3-5A);單獨的Atenolol和Bupranolol對T淋巴細胞的增殖沒有影響(P0.05) (圖3-5B),這一結(jié)果提示,β1-AA促進ConA激活的T淋巴細胞的增殖效應(yīng)可以部分通過β1-AR發(fā)揮。加入β1-AA后,胞漿中cAMP水平由加入前的120±6.8 pmol/mL增加為300±7.5pmol/mL(P0.01),提示β1-AA可以使胞漿中cAMP水平升高,再分別加入β1-AR的阻斷劑Atenolol和β-AR阻斷劑Bupranolol以后,cAMP水平分別改變?yōu)?01±8.3(P0.05)和125±8.9(P0.01),提示CAMP水平的升高不能被β1-AR阻斷劑Atenolol完全阻斷,但可以被β-AR阻斷劑Bupranolol完全阻斷(圖3-6);進一步的研究發(fā)現(xiàn),PKA的抑制劑H-89也只能部分降低β1-AA促進的T淋巴細胞的增殖效應(yīng),OD值由0.61±0.04變化為0.51±0.03(P0.05)(圖3-7A),而單獨的H-89對ConA刺激的T淋巴細胞的增殖沒有影響(P0.05)(圖3-7B)。 這一結(jié)果提示:β1-AA有可能部分通過β1-AR-cAMP-PKA途徑,促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖。除了此途徑外,可能還有其他通路參與。 3.2.2β1-AA促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖可以部分通過β2-AR-cAMP-PKA途徑 為了進一步分析β1-AA促進人外周血T淋巴細胞增殖的作用途徑,本研究將β2-AR阻斷劑ICI118,551以及β1-AR和β2-AR阻斷劑Nadolol分別作用于β1-AA處理的的T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)其促增殖作用也只能被ICI118,551部分阻斷,但是,Nadolol可以完全阻斷β1-AA的促T淋巴細胞的增殖作用(圖3-8A),阻斷劑本身對ConA激活的T淋巴細胞增殖沒有影響(圖3-8B),這一結(jié)果提示β1-AA的促增殖作用可以通過β2-AR進行。而且升高的cAMP水平不能被ICI118,551完全阻斷,但可以被Nadolol完全阻斷(P0.05)(圖3-9)。 這一結(jié)果提示:β1-AA促進ConA激活的人T淋巴細胞的增殖效應(yīng)除了通過β1-AR外,還有β2-AR-cAMP-PKA途徑參與。3.2.3β1-AA促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的增殖還可以通過β1/β2-AR-PKC途徑 鑒于β1-AA的促增殖作用不能完全被PKA抑制劑H-89所完全阻斷,本研究選用PKC的抑制劑chelerythrine(白屈菜赤堿)作用于T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)其可以部分抑制β1-AA促進的T淋巴細胞的增殖作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),PKC和PKA的抑制劑共同干預也可以完全抑制β1-AA促進的T淋巴細胞的增殖(圖3-10)。 由于β1/β2-AR的激活均可以激活PKC,那么,在β1-AA促進人T淋巴細胞的增殖過程中涉及到的PKC是來自β1-AR還是β2-AR的激活,本課題進行了如下實驗:首先將β2-AR受體途徑阻斷(ICI118,551),再加入PKA的抑制劑H-89,發(fā)現(xiàn),β1-AA的促增殖作用不能完全阻斷,繼續(xù)加入PKC抑制劑chelerythrine后,β1-AA的促增殖作用才可完全被阻斷(圖3-11)。而先將β1-AR受體途徑阻斷(Atenolol),然后再加入H-89,也發(fā)現(xiàn)β1-AA的促增殖作用不能完全阻斷,再加入chelerythrine后,其增殖作用才可完全被阻斷(圖3-12)。 這一結(jié)果提示:β1/β2-AR-PKC通路也是β1-AA促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞增殖的途徑之一。 4β1-AA可以促進ConA激活的人外周血T淋巴細胞的分泌功能T淋巴細胞不同功能的發(fā)揮取決于分泌細胞因子的種類,本研究檢測了IL-2,IFN-γ以及IL-4的分泌水平來反映機體細胞免疫和體液免疫功能。我們將不同濃度(0.01,0.1,1μM)的β1-AA分別作用于ConA刺激的人外周血T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)IL-2的分泌水平由加入前的26.3±3.1pg/ml,25.0±2.5 pg/ml,26.8±2.8pg/ml分別增加為33.2±2.4pg/m(lP0.05),42.0±3.0pg/ml( P0.01)和51±2.8pg/ml(P0.01),IFN-γ的分泌水平由43±3.2pg/ml,44±2.5pg/ml,46±4.1pg/ml增加為53±2.6pg/ml(P0.05),68±3.0pg/ml(P0.01)和73±3.4pg/ml(P0.01),IL-4的分泌水平增加為33.0±3.2pg/ml(P0.05),48.0±4.2pg/ml(P0.01)和51±3.9pg/ml(P0.01),遠高于處理前的24.0±2.6pg/ml,22±3.1 pg/ml和23±3.7pg/ml,提示β1-AA可濃度依賴性地促進ConA刺激的人外周血T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ以及IL-4水平(圖3-13A,3-14A,3-15A)。但是,從陰性血清中提取的IgGs不能促進這些細胞因子的生成增加,β1-AA促進T淋巴細胞分泌這些細胞因子的作用可以被β1-AR細胞外第二環(huán)的抗原肽段中和(圖3-13B,3-14B,3-15B),提示:β1-AA可以促進這些細胞因子的分泌。并且,這些細胞因子水平的升高可以分別被β1-AR的選擇性阻斷劑Atenolol和β2-AR的阻斷劑ICI118,551部分阻斷;可以被β-AR的阻斷劑Bupranolol以及β1-AR和β2-AR阻斷劑Nadolol完全阻斷(圖3-13C,3-14C,3-15C),提示:β1-AA可以通過β1/β2-AR促進這些細胞因子的分泌。 小結(jié)三 1.β1-AA能夠濃度依賴性促進ConA刺激的人外周血T淋巴細胞增殖,并且這種作用可能是通過激活β1-AR和β2-AR(β1/β2-AR)兩條途徑實現(xiàn)的。 2.β1-AA可以通過β1/β2-AR促進人外周血T淋巴細胞的分泌功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R33

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3 徐東平;福軍亮;金磊;張輝;周春保;鄒正升;趙景民;施明;丁熙來;湯紫榮;付陽新;張玲霞;王福生;;乙型肝炎患者外周血和肝組織CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞的特點和意義[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 李莉;黃麗麗;;米非司酮對人外周血來源樹突狀細胞成熟的影響[A];2009中國杭州生殖健康學術(shù)論壇暨浙江省計劃生育學與生殖醫(yī)學分會學術(shù)年會論文匯編[C];2009年

5 王偉;楊肅文;張宏娟;魏建波;;類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血FoxP3~+CD4~+CD25~+T細胞的檢測及意義[A];浙江省免疫學會第六次學術(shù)研討會論文匯編[C];2007年

6 王傲雪;齊曉怡;林茂;于洋;胡瑩;涂彩霞;;芍藥苷對人外周血T淋巴細胞的影響(摘要)[A];第五屆全國中西醫(yī)結(jié)合變態(tài)反應(yīng)學術(shù)會議論文集[C];2011年

7 葛薇;李長虹;張偉;韓欽;鄧為民;尤勝國;趙春華;;白血病細胞凍融物沖擊的DCs增強人外周血CIK細胞抗腫瘤免疫研究[A];第九屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2003年

8 王峰;薛勤;汪年松;晏春根;高許萍;張曉光;俞崗;崔勇平;唐令詮;;活動期類風濕關(guān)節(jié)炎外周血CD62P的表述[A];首屆全國中青年風濕病學學術(shù)大會論文匯編[C];2004年

9 薛勤;汪年松;高許萍;張曉光;范瑛;唐令詮;;強直性脊柱炎患者外周血CD62P的改變及意義[A];第十二屆全國風濕病學學術(shù)會議論文集[C];2007年

10 王建明;閻小萍;;強直性脊柱炎患者外周血T輔助細胞亞群的變化[A];第十二屆全國風濕病學學術(shù)會議論文集[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 陳四清;“中藥抗癌”要說清楚[N];遼寧日報;2000年

2 陳代雄邋本報記者 余昌旭;遵醫(yī)附院實施我省首例新一代腫瘤過繼免疫治療[N];貴州日報;2008年

3 吳一福;MTHFRC667T基因分型技術(shù)問世[N];中國醫(yī)藥報;2005年

4 本報記者　 王華鋒;今年花開別樣紅[N];中國醫(yī)藥報;2006年

5 馮磊;解毒法能明顯改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡病變進程[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

6 大辛;胰島素與糖尿病[N];新疆科技報(漢);2000年

7 通訊員 吳延華 記者 海霞;阿膠二次開發(fā)獲新突破[N];中國食品質(zhì)量報;2003年

8 陶春祥;NO的抗炎作用研究[N];中國醫(yī)藥報;2004年

9 周愛誼;白細胞減少應(yīng)吃什么[N];上海中醫(yī)藥報;2001年

10 ;檢測艾滋病人外周血細胞內(nèi)病毒新方法問世[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導報;2003年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 王瑾;抗β1-腎上腺素受體自身抗體對T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響[D];山西醫(yī)科大學;2011年

2 李莉;米非司酮對人外周血來源樹突狀細胞成熟和功能的影響[D];浙江大學;2010年

3 梁晨;干擾素-γ與骨髓間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)協(xié)同作用機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2010年

4 池詔丞;甲胎蛋白對樹突狀細胞功能及其凋亡的影響[D];吉林大學;2007年

5 吳塵軒;增強樹突狀細胞及其相關(guān)exosome抗肝癌免疫效應(yīng)的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2008年

6 郝勝華;移植病人淋巴細胞P-gp表達水平的改變及其臨床意義的研究[D];中南大學;2008年

7 王輝;在T淋巴細胞中生長激素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其功能的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1999年

8 欒好江;B淋巴細胞中生長激素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2001年

9 賈嫻嫻;CCK-8對人外周血漿細胞樣樹突狀細胞成熟和活化的調(diào)節(jié)[D];河北醫(yī)科大學;2012年

10 袁紅艷;人源陽離子抗菌肽hCAP-18/LL-37的基因克隆與真核表達及其對樹突狀細胞分化成熟的影響[D];吉林大學;2007年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 盛明雄;苦杏仁甙免疫活性和抗腎臟纖維化作用的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

2 禚守蓉;XGD-1對人外周血T淋巴細胞增殖和IL-2R表達的影響[D];昆明醫(yī)學院;2003年

3 俞文淵;IL-12、IFN-γ協(xié)同共刺激分子B7-1誘導肝癌細胞腫瘤免疫的實驗研究[D];蘇州大學;2003年

4 杜珍;β-胡蘿卜素補充對青年和老年人群機體細胞功能影響的研究[D];青島大學;2005年

5 侯震暉;不明原因早期自然流產(chǎn)體外反應(yīng)體系中蛻膜淋巴細胞增殖和絨毛滋養(yǎng)細胞凋亡[D];四川大學;2004年

6 李林;黃芩苷對腦缺血再灌注小鼠及其免疫系統(tǒng)的保護作用[D];暨南大學;2009年

7 孫臣心;姬松茸多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性研究[D];東北師范大學;2009年

8 林祥吉;山仔水華微囊藻毒素對小鼠淋巴細胞免疫功能的影響及其機理研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

9 田野;膠體金對小鼠免疫活性影響的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2007年

10 殷玉俊;間充質(zhì)干細胞對淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究[D];江蘇大學;2008年

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本文編號：1884356