發(fā)布時間：2018-05-12 22:37

  本文選題：神經(jīng)干細胞 + 分化��； 參考：《蘇州大學》2011年博士論文

【摘要】：在胚胎發(fā)育過程中,神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)不斷遷移至特定區(qū)域,形成新皮質等結構功能單位,構建出復雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng),反之,發(fā)育期的NSCs遷移缺陷將導致許多神經(jīng)退行性疾病;成體NSCs同樣保留了這一特性,哺乳動物海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)、腦室下區(qū)(subventricular zone, SVZ)的NSCs不斷遷移至特定區(qū)域維持海馬和嗅球(olfactory bulb, OB)的神經(jīng)發(fā)生;重要的是,內源或外源移植的NSCs均可以經(jīng)過長距離遷移定位于神經(jīng)損傷區(qū)域,因此可通過體外移植和體內激活NSCs,重建受損的神經(jīng)環(huán)路,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟新途徑。 NSCs的定向遷移在體內、外實驗中均得到了證實,這種遷移的內在機制吸引了越來越多的研究和關注。研究發(fā)現(xiàn),許多生長因子可以介導NSCs的定向遷移,其中包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),它可以和細胞膜上的血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)結合,激活細胞外信號調節(jié)激酶(extracelluar signal regulated kinases-1/2, ERK1/2 )、應激活化蛋白激酶/c-jun氨基末端激酶( stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase, SAPK/JNK)、p38MAPK和磷脂酰肌醇3激酶/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/Akt, PI3K/Akt)信號通路,進而介導細胞的增殖、分化和遷移。在接受外部刺激后,絲裂霉素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)和PI3K/Akt信號通路將作用于胞內信號分子進而影響細胞骨架相關蛋白,調節(jié)細胞偽足的形成及遷移。生理條件下,VEGF是NSCs沿著吻側遷移流(Rostral migratory stream, RMS)向OB方向遷移的一個重要調節(jié)因子;體外實驗也發(fā)現(xiàn),VEGF可以誘導NSCs的定向遷移;并且神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)域會分泌VEGF,誘導NSCs遷移至神經(jīng)損傷區(qū)域,幫助損傷區(qū)域結構和功能的重建,表明VEGF在神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)損傷修復中具有重要的作用。 細胞的遷移涉及到肌動蛋白的聚合、細胞的黏附和肌球蛋白的收縮,在遷移過程中細胞向趨化因子方向伸出偽足,然后牽拉胞體運動。細胞在受到VEGF刺激之后,其內部的黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)及樁蛋白(paxillin)發(fā)生磷酸化進而招募踝蛋白(talin)和紐蛋白(vinculin)等肌動蛋白錨定蛋白形成黏著斑,參與細胞的遷移。paxillin表達降低或者缺失會導致細胞形態(tài)變圓,扁平偽足不能形成,黏附及遷移能力下降,而成纖維細胞缺失該基因后表現(xiàn)出遷移能力缺陷,說明paxillin在細胞的遷移中扮演著重要的角色。 盡管NSCs能夠遷移至神經(jīng)損傷區(qū)域,但研究發(fā)現(xiàn)并不是所有移植入體內的NSCs都具有這種定向遷移能力,大部分移植的細胞停留在原地,只有小部分移植入體內的NSCs可以遷移至損傷區(qū)域,說明對趨化因子產(chǎn)生應答的可能只是一少部分細胞。體外實驗也發(fā)現(xiàn),將50 ng/ml的VEGF加入到神經(jīng)球的培養(yǎng)基中,從神經(jīng)球中向外遷移的細胞距離明顯變長,并且通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),這些向外遷移的細胞呈GFAP和nestin陽性,而位于神經(jīng)球中心的細胞不帶有上述的標志物。因此我們推測細胞的遷移能力和它們的分化狀態(tài)密切相關,不同分化狀態(tài)的細胞對VEGF的應答不同。為了驗證上述假說,我們選用了來源于新生小鼠小腦的NSCs細胞系C17.2細胞,檢測了VEGF誘導的NSCs的定向遷移和它們分化狀態(tài)之間的關系,得到了以下結果: 神經(jīng)干細胞的分化過程具有可塑性為了探討NSCs的趨化性遷移和它們分化狀態(tài)之間的關系,將融合度達50%的C17.2細胞換用誘導培養(yǎng)基,分別取分化0 h(未分化)、12 h、1 d和3 d的細胞進行免疫熒光染色。結果發(fā)現(xiàn),未分化的C17.2細胞表達神經(jīng)干細胞的表面標志物nestin,不表達其它神經(jīng)類細胞的表面標志物A2B5、GFAP、β-III-tubulin和NSE。隨著分化時間的延長,表達nestin的細胞比例逐漸下降,而表達A2B5、GFAP或β-III-tubulin的細胞比例逐漸增加;在整個分化過程中我們始終沒有檢測到成熟神經(jīng)元標志物NSE的表達。接著我們將分化12 h、1 d和3 d的細胞重新培養(yǎng)在含血清的完全培養(yǎng)基中,48 h后發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元樣和星形膠質細胞樣形態(tài)的細胞又返回到了未分化時的形態(tài),主要呈現(xiàn)梭形或三角形,并且細胞出現(xiàn)了大量增殖的現(xiàn)象。說明這些分化的細胞只是處于NSCs分化的早期或是過渡階段,還不是真正成熟的神經(jīng)類細胞。 神經(jīng)干細胞的遷移與它們的分化狀態(tài)密切相關利用Boyden chamber我們檢測了不同濃度的NSCs誘導分化0 h、12 h、1 d和3 d NSCs的定向遷移情況。結果發(fā)現(xiàn),未分化的細胞對25和50 ng/ml的VEGF表現(xiàn)出了趨向性遷移,而5和100 ng/ml的VEGF對未分化細胞的遷移沒有影響。但同時我們發(fā)現(xiàn)分化1 d和3 d的細胞對所有濃度的VEGF均表現(xiàn)出了趨向性遷移;而分化12 h的細胞對5、25和50 ng/ml的VEGF表現(xiàn)出了趨化性遷移。并且誘導分化0 h、12 h、1 d和3 d細胞產(chǎn)生最大遷移細胞數(shù)的VEGF的濃度不同,分別為25、5、25和50 ng/ml;VEGF誘導所產(chǎn)生的最大遷移細胞數(shù)在未分化和分化12 h、1 d、3 d的細胞中也不相同,分別是對照組的1.68、2.16、3.18和3.16倍。這說明不同分化狀態(tài)的細胞對VEGF的應答不同,NSCs的定向遷移行為和它們的分化狀態(tài)密切相關。 分化某一特定階段的細胞擁有較強的定向遷移能力既然細胞的分化狀態(tài)影響它們的遷移行為,是否存在某一特定分化狀態(tài)的NSCs向VEGF的定向遷移能力最強呢?通過Boyden chamber我們檢測了25 ng/ml VEGF誘導不同分化狀態(tài)NSCs的定向遷移。盡管未分化和分化12 h、1 d、3 d的細胞對25 ng/ml VEGF都能產(chǎn)生趨化性遷移,但相比于其它分化狀態(tài)的細胞來說,分化1 d的細胞向VEGF遷移的細胞數(shù)最多,說明分化1 d的細胞相比于其它分化狀態(tài)的細胞來說,擁有較強的定向遷移能力。接著利用Dunn chamber和延時動態(tài)視頻(time-lapse video)跟蹤拍攝,我們檢測了不同分化狀態(tài)細胞在VEGF刺激下的具體遷移指標,包括細胞的遷移速率和遷移效率。結果發(fā)現(xiàn)不同分化狀態(tài)細胞間的遷移速率沒有差異,但它們向VEGF遷移的效率并不相同,呈時間依賴的雙相性曲線,并且和Boyden chamber結果一致,分化1 d的細胞對VEGF表現(xiàn)出了最強的遷移持續(xù)性,其明顯高于未分化和分化12 h的細胞。 通過上述實驗,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞的遷移行為和它們的分化狀態(tài)密切相關,并且某一特定分化階段的細胞向VEGF的遷移持續(xù)性最強,接著我們又檢測了原代培養(yǎng)的NSCs的分化狀態(tài)和它們遷移行為之間的關系。將新生SD大鼠SVZ的NSCs培養(yǎng)在matrigel包被的細胞培養(yǎng)皿中,鏡下觀察未分化的細胞呈兩極或三極形態(tài),大部分細胞呈現(xiàn)nestin陽性。隨后將其培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)基中,48 h后可見細胞由原來的二極或三極的簡單形態(tài)變?yōu)榫哂休^多和較長分叉的復雜結構,并且細胞表達β-III-tubulin或GFAP,說明NSCs正經(jīng)歷從NSCs向神經(jīng)類細胞的轉變過程中。接著我們選取了分化0 h(未分化)、12 h、24 h和36 h的NSCs,通過延時動態(tài)視頻跟蹤,觀察了這些不同分化狀態(tài)的NSCs在5 ng/ml VEGF刺激下的遷移行為。結果發(fā)現(xiàn)分化36 h細胞的遷移速率明顯小于未分化和分化12 h的細胞,但其與分化24 h的細胞沒有差別。進一步分析細胞的遷移效率發(fā)現(xiàn),遷移效率的變化呈現(xiàn)出時間依賴的雙相性曲線,分化12 h的細胞對VEGF的刺激展現(xiàn)出了最強的遷移持續(xù)性,再次驗證了VEGF刺激下的細胞遷移行為依賴于它們的分化狀態(tài),并且某一特定分化階段的細胞具有較強的遷移能力。 VEGF刺激后,MAPKs、PI3K/Akt以及paxillin在不同分化狀態(tài)NSCs中的表達不同我們前期實驗發(fā)現(xiàn)NSCs的趨向性遷移和它們的分化狀態(tài)相關,那么和細胞遷移相關的MAPKs和PI3K/Akt信號通路對VEGF的應答是否也受細胞分化狀態(tài)的影響呢?我們通過western blot檢測了VEGF處理5、15、30、60和720 min的不同分化狀態(tài)的細胞,檢測了不同分化狀態(tài)的細胞對VEGF的應答差異。結果發(fā)現(xiàn),VEGF處理細胞5 min后,不論是未分化還是分化的細胞,Akt的磷酸化水平都顯著升高,并隨著VEGF刺激時間的增加維持穩(wěn)定表達。同樣的,VEGF處理細胞5 min后,p-ERK1/2的表達水平也得到了顯著性升高,但不同分化狀態(tài)的細胞中p-ERK1/2活化持續(xù)的時間并不相同,在分化3 d的細胞中p-ERK1/2的增量表達維持到60 min。而在未分化、分化12 h和1 d的細胞中,p-ERK1/2分別在VEGF處理15min、30 min和30 min后恢復到正常表達水平。在不同分化狀態(tài)的C17.2細胞中,SAPK/JNK的基礎性磷酸化表達水平較低,但VEGF作用5 min后,不同分化狀態(tài)的細胞中均出現(xiàn)了SAPK/JNK蛋白磷酸化水平增高的現(xiàn)象,和p-ERK1/2表達相似,分化0 h、12 h、1 d和3 d細胞中升高的磷酸化的持續(xù)時間并不相同,分別持續(xù)30 min、1 h、12 h和12 h。而VEGF誘導的p38MAPK的磷酸化只在分化3 d的細胞中出現(xiàn),VEGF處理15 min時表達增高,30 min后消失。這些結果說明,不同分化狀態(tài)的細胞中PI3K/Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK對VEGF的應答存在著差異。接著我們通過免疫熒光染色鑒定了和細胞遷移密切相關的paxillin和F-actin的表達和分布,結果發(fā)現(xiàn),VEGF刺激細胞5 min后,未分化細胞中paxillin的表達增強,熒光強度和分布面積都得到了顯著性升高,F-actin形成整齊的縱向平行排列的纖維,在VEGF作用60 min時,這種現(xiàn)象依舊存在。同時,分化12 h和1 d的細胞在VEGF作用1 min后細胞骨架排列顯著有序于未經(jīng)VEGF刺激的NSCs,并且paxillin偏向于分布在細胞的周圍,在我們所檢測的60 min內paxillin的表達升高和F-actin整齊排列的現(xiàn)象一直存在。然而,在分化3 d的細胞中paxillin和F-actin的表達及細胞內分布變化不大。 MAPKs和PI3K/Akt參與調控不同分化狀態(tài)的NSCs向VEGF的遷移MAPKs和PI3K/Akt信號通路對VEGF的應答隨著細胞分化狀態(tài)的改變而改變,那么這些信號通路在NSCs向VEGF的定向遷移過程中有沒有作用呢?接著我們分別用MAPKs和PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑處理細胞,利用Boyden chamber檢測了在抑制劑存在的情況下,不同分化狀態(tài)的細胞向VEGF的趨化性遷移情況。結果發(fā)現(xiàn),抑制p38MAPK或SAPK/JNK信號通路后,細胞向VEGF的趨向性遷移沒有受到影響;而加入ERK1/2的抑制劑PD98059后,未分化和分化細胞向VEGF的定向遷移行為都受到了抑制;同時我們發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt的抑制劑LY294002只降低了分化12 h細胞的定向遷移,未分化和分化1 d、3 d的細胞在LY294002存在的情況下仍舊可以向VEGF的濃度方向遷移。說明PI3K/Akt只在分化12 h的細胞中參與調控NSCs的定向遷移,而ERK1/2信號通路在未分化和分化細胞的定向遷移中均扮演著重要的角色。接著我們通過Dunn chamber進一步研究了細胞在抑制劑存在條件下的趨化性遷移。結果發(fā)現(xiàn),ERK1/2信號通路的失活導致了未分化和分化細胞的遷移速率和遷移效率的下降;而PI3K/Akt的抑制劑LY294002只降低了分化12 h和1 d細胞的遷移效率,未分化和分化3 d細胞的遷移效率以及未分化和分化條件下細胞的遷移速率都沒有受到影響。和Boyden chamber實驗不同的是,盡管SAPK/JNK或p38MAPK信號通路不參與調控細胞的定向遷移行為,但動態(tài)視頻跟蹤細胞,由imageJ軟件統(tǒng)計分析細胞的遷移速率和遷移效率可見,p38MAPK的抑制劑SB203580顯著降低了分化0 h、12 h和1 d細胞的遷移速率以及分化12 h、1 d和3 d細胞的遷移效率;同時我們發(fā)現(xiàn)SAPK/JNK的抑制劑SP600125顯著抑制了未分化和分化1 d細胞的遷移速率,分化12 h和3 d細胞的遷移速率以及各個分化狀態(tài)下的細胞遷移效率沒有受到影響。這說明SAPK/JNK和p38MAPK信號通路參與控制細胞的遷移速率和遷移效率,但并不參與調控NSCs向VEGF遷移的方向性。綜上所述,這些結果說明不同分化狀態(tài)的細胞對PI3K/Akt或MAPKs抑制劑的反應不同,進而證實了細胞的遷移行為和它們的分化狀態(tài)密切相關。 NSCs的體內遷移是神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的關鍵因素,其遷移過程并不可能只受到一種因子的調節(jié)。事實上,許多因子,包括肝細胞生長因子、干細胞因子、血小板來源的生長因子和單核細胞趨化蛋白-1等都參與調控NSCs的遷移。我們的結果顯示分化特定階段的細胞相比于其它狀態(tài)的細胞來說,擁有較強的趨向遷移能力,說明NSCs的分化狀態(tài)在NSCs的定向遷移中扮演著重要的角色。那么相對于未分化和其它分化狀態(tài)的細胞來說,移植分化特定階段的細胞將有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位結構和功能的恢復。同時,我們還需要更多的實驗來識別這些遷移能力強的細胞,進一步探討調控遷移的細胞和分子的機制,為臨床應用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：1880444