本文選題：microRNA-26a + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《遼寧醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞芯片篩查結(jié)果擬利用小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化模型從基因、蛋白水平及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探討miR-26a在成骨分化中的表達(dá)趨勢及對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控作用，并進(jìn)一步探討miR-26a對(duì)骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。 方法 （1）采用卵巢切除法成功建OPM小鼠模型，使用全骨髓法分離培養(yǎng)骨質(zhì)疏松小鼠的BMSCs(O-BMSCs)、假手術(shù)小鼠的BMSCs(S-BMSCs)和正常小鼠的BMSCs（N-BMSCs）。通過測定生長曲線、計(jì)算克隆形成率、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表型分子對(duì)BMSCs進(jìn)行初步干細(xì)胞鑒定；（2）利用成骨誘導(dǎo)液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14d，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-PCR，RT-PCR）檢測誘導(dǎo)3、7、10、14d后的miR-26a及成骨基因（Runx-2、OCN、Col-1）表達(dá)，同時(shí)利用Western blot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果。（3）miR-26a在BMSCs中的功能實(shí)驗(yàn),使用miR-26a的促進(jìn)物miR-RiboTMmicroRNA-26a mimics及miR-26a抑制物miR-RiboTMmicroRNA-26a inhibitor通過siPORTTMNeoFXTMagent轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs，3d后加入成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),并同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染microRNA-26a mimics NC的對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)7d、14d后,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色、鈣鹽結(jié)節(jié)（茜素紅染色）的檢測；RT-PCR檢測誘導(dǎo)10d后的miR-26a及成骨基因（Runx-2、OCN、Col-1）的表達(dá)變化。（4）提取OVX組及Sham組BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，，RT-PCR、Western blot檢測OVX組中miR-26a及成骨基因（Runx-2、OCN、Col-1）的表達(dá)。（5）miR-RiboTMmicroRNA-26a mimics復(fù)合HA/TACP材料植入裸鼠皮下及大鼠腎被膜下，兩月后取材，HE切片檢測成骨情況。 結(jié)果 （1）干細(xì)胞的分離與初步鑒定：成功培養(yǎng)小鼠N-BMSCs、O-BMSCs和S-BMSCs，生長曲線顯示O-BMSCs的增殖能力低于S-BMSCs，克隆形成率顯示O-BMSCs克隆形成率低于S-BMSCs的克隆形成率，成骨誘導(dǎo)后，ALP染色、茜素紅染色和RT-PCR檢測成骨分化能力顯示O-BMSCs低于S-BMSCs； （2）miR-26a與BMSCs的成骨分化：RT-PCR檢測在BMSCs向成骨分化過程中miR-26a的表達(dá)上升了約25倍，成骨基因表達(dá)也隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。轉(zhuǎn)染miR-26a mimics后的BMSCs在培養(yǎng)7d后細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)樾《贪魻睿瑯渲�，無明顯成纖維狀，與陰性對(duì)照組類似；ALP染色顯示試驗(yàn)組在培養(yǎng)7d就呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，較對(duì)照組顏色深，茜素紅染色顯示試驗(yàn)組培養(yǎng)14d后即出現(xiàn)了數(shù)量較多的大小不等的深紅色鈣鹽結(jié)節(jié),而陰性對(duì)照組則出現(xiàn)較少、較零散的鈣鹽結(jié)節(jié)。RT-PCR檢測上調(diào)miR-26a后成骨基因的表達(dá)均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，Western Blot檢測結(jié)果同RT-PCR。 （3）OVX組別中miR-26a及成骨基因的表達(dá)：RT-PCR檢測結(jié)果顯示OVX組中miR-26a的表達(dá)低于Sham組4倍左右，成骨基因的表達(dá)也低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，Western Blot結(jié)果同RT-PCR。 （4）HE切片顯示miR-26a mimics組成骨能力顯著優(yōu)于對(duì)照組。 結(jié)論 （1）OPM中的BMSCs表現(xiàn)為增殖活性降低、成骨分化能力降低的生物學(xué)特性。 （2）本次實(shí)驗(yàn)首次驗(yàn)證了miR-26a與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)系，證實(shí)了miR-26a具有促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。 （3）miR-26a可能有恢復(fù)O-BMSCs的成骨能力，可能作為治療OPM的新靶點(diǎn)，從而將骨代謝性疾病如骨質(zhì)疏松癥等發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步深化入干細(xì)胞及miRNAs水平。
[Abstract]:Purpose

Based on the results of bone marrow mesenchymal stem cell microarray screening , the expression of miR - 26a in osteogenic differentiation and the role of miR - 26a on bone marrow mesenchymal stem cells were investigated by using bone - forming differentiation model of mouse bone marrow mesenchymal stem cells . The mechanism of miR - 26a on osteoporosis was further discussed .

method

( 1 ) The mouse model was successfully constructed by the ovary resection method , and the bone marrow method was used to separate the bone marrow cells ( O - MSCs ) of the mouse with osteoporosis , the bone marrow cells of the sham - operated mice ( S - bone marrow cells ) and normal mice . The growth curve was measured , the clone formation rate was calculated , the flow cytometry was used to detect the cell phenotype molecules for the preliminary stem cell identification ;
( 2 ) The expression of miR - 26a and osteogenic genes ( Runx - 2 , OCN , Col - 1 ) after 3 , 7 , 10 and 14 days was detected by real time - polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . The expression of miR - 26a and osteogenic genes ( Runx - 2 , OCN , Col - 1 ) was detected by Western blot .
The expression of miR - 26a and osteogenic genes ( Runx - 2 , OCN , Col - 1 ) after 10d was detected by RT - PCR . ( 4 ) The expression of miR - 26a and osteogenic genes ( Runx - 2 , OCN , Col - 1 ) was detected by RT - PCR and Western blot .

Results

( 1 ) Isolation and preliminary identification of stem cells : The growth curve showed that the proliferation ability of O - cells was lower than that of S - BMSC , and the growth curve showed that the growth rate of O - BMSC was lower than that of S - bone marrow , and the formation rate of the clones was lower than that of S - bone marrow . After osteogenic induction , ALP staining , alizarin red staining and RT - PCR were used to detect the bone differentiation ability .


( 2 ) The expression of miR - 26a was increased by about 25 times in the process of osteogenic differentiation by RT - PCR . The expression of miR - 26a increased gradually with the increase of induction days ( P0.05 ) .
Compared with the control group , the expression of the osteogenic gene was higher in the negative control group than in the control group ( P0.05 ) . The results of Western Blot were compared with RT - PCR .

( 3 ) The expression of miR - 26a and osteogenic genes in ovariectomized group : RT - PCR showed that the expression of miR - 26a was lower than that in Sham group , and the expression of osteogenic gene was lower than that in Sham group ( P0.05 ) . Western Blot analysis was similar to RT - PCR .

( 4 ) HE section showed that the ability of miR - 26a cells to make up bone was superior to that of the control group .

Conclusion

( 1 ) There was a decrease in proliferation activity and a decrease in osteogenic differentiation ability .

( 2 ) For the first time , the relationship between miR - 26a and bone marrow mesenchymal stem cells was verified , and it was confirmed that miR - 26a had the effect of promoting the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone .

( 3 ) miR - 26a may have the ability to restore the osteogenic ability of O - cells , which may be used as a new target for the treatment , so that the pathogenesis of bone metabolic diseases such as osteoporosis can be further deepened into the stem cell and the miRNA level .

【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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