本文選題：人內(nèi)皮祖細(xì)胞 + 脂聯(lián)素�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的 內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)又稱為成血管細(xì)胞，不僅參與胚胎時(shí)期的血管生成，而且參與出生后的血管新生與內(nèi)皮損傷修復(fù)。糖尿病合并心血管并發(fā)癥患者的EPCs數(shù)量減少，功能減退，能夠?qū)е卵茉賰?nèi)皮化及修復(fù)過(guò)程受損。脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是一種脂肪源性血漿蛋白，對(duì)心血管具有保護(hù)作用。APN具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，可促進(jìn)血管生成；另外，APN還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，來(lái)減少心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌肥厚性重構(gòu)。大量研究證明，經(jīng)過(guò)APN干預(yù)，可使EPCs的數(shù)量增加。然而，APN是否能改善高糖環(huán)境下EPCs的數(shù)量和功能尚未清楚。為此，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)給予EPCs不同濃度的葡萄糖干預(yù)，觀察葡萄糖對(duì)EPCs數(shù)量和功能的影響；在此基礎(chǔ)上，給予不同濃度的APN干預(yù)，觀察各濃度APN對(duì)高糖損傷后EPCs數(shù)量和功能的影響以明確APN對(duì)EPCs的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制，為臨床治療代謝綜合征性心血管疾病提供新的干預(yù)靶點(diǎn)和必要的科學(xué)理論依據(jù)。 方法 1、EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞分子標(biāo)志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞攝取ac-LDL和結(jié)合UEA-I鑒定。 2、不同濃度葡萄糖對(duì)EPCs的影響：收集培養(yǎng)4d的細(xì)胞，給予不同濃度的葡萄糖(5.5、20、25、30、50mmol/l)干預(yù)48h，同步化后用MTT比色法檢測(cè)EPCs的增殖能力；用Annexin V-FITC法檢測(cè)EPCs的凋亡率；用熒光探針(DCFH-DA)檢測(cè)法進(jìn)行細(xì)胞活性氧(ROS)水平檢測(cè)。 3、APN對(duì)高糖環(huán)境下EPCs的影響：將培養(yǎng)4d的EPCs分為7組：其中3組細(xì)胞分別給予5.5mmol/l葡萄糖、5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇、30mmol/l葡萄糖干預(yù)96h，其余4組細(xì)胞先給予30mmol/l葡萄糖干預(yù)48h，然后分別給予：1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml APN干預(yù)48h。收集細(xì)胞，同步化后檢測(cè)EPCs的增殖、遷移、凋亡及ROS水平。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法：用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X|-±s表示，組間資料比較采用ANOVA，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、EPCs培養(yǎng)和鑒定：密度梯度離心法分離出的外周血單個(gè)核細(xì)胞圓形透亮，培養(yǎng)4d后出現(xiàn)短梭形貼壁細(xì)胞，并有典型細(xì)胞集落；培養(yǎng)7d，細(xì)胞集落增加明顯，梭形細(xì)胞增多并呈交叉性生長(zhǎng)；用激光共聚焦倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞攝取DiI-acLDL呈紅色熒光，攝取FITC-UEA-I呈綠色熒光，，攝取DiI-acLDL并結(jié)合FITC-UEA-I的細(xì)胞呈黃色熒光，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示：細(xì)胞表達(dá)KDR、CD133、CD34，其中KDR、CD133、CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例為92.32%、10.7%、23.3%。證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是正在分化的EPCs。 2、不同糖濃度對(duì)EPCs的影響：當(dāng)糖濃度分別為5.5mmol/l、20mmol/l、25mmol/l、30mmol/l、50mmol/l時(shí)MTT法測(cè)出的A值分別為(0.287±0.031)、(0.252±0.034)、(0.242±0.019)、(0.215±0.024)、(0.208±0.017)，凋亡率分別為(8.495±1.279)%、(12.942±1.177)%、(14.770±1.438)%、(16.393±1.216)%、(17.502±1.259)%，DCF法測(cè)出的ROS水平(OD值)分別為(0.361±0.053)、(0.468±0.090)、(0.483±0.053)、(0.518±0.081)、(0.613±0.098)。結(jié)果提示，隨著糖濃度的增高，EPCs的增殖能力下降，凋亡、ROS水平增加(P0.01)；其中當(dāng)糖濃度為30mmol/l與50mmol/l時(shí)，兩者相比對(duì)EPCs的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3、APN對(duì)高糖損傷后EPCs的影響：對(duì)以下7組細(xì)胞(5.5mmol/l葡萄糖組、高滲組、30mmol/l高糖組、高糖+1.25μg/mlAPN組、高糖+2.5μg/mlAPN組、高糖+5μg/mlAPN組、高糖+10μg/ml APN組)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果分析后可以看出與正常糖濃度對(duì)照組相比，高滲對(duì)照組EPCs的增殖、遷移、凋亡和ROS水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，卻顯著高于高糖組，說(shuō)明高糖對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響是糖濃度造成的，而非滲透壓。在30mmol/l葡萄糖條件下，EPCs的數(shù)量和遷移功能較正常對(duì)照組明顯下降，細(xì)胞凋亡增多，不同濃度APN干預(yù)后能明顯提高高糖損傷后的EPCs的功能(P0.05)，隨著APN濃度的增加，EPCs的增殖與遷移能力增高，凋亡、ROS水平下降(P0.01)。 結(jié)論 1、高糖干預(yù)可導(dǎo)致EPCs增殖能力下降，細(xì)胞凋亡增多； 2、高糖干預(yù)后加入APN，EPCs的增殖、遷移能力恢復(fù)，細(xì)胞凋亡減少，并在一定范圍內(nèi)，其作用隨濃度的增加而增強(qiáng)； 3、高糖可以引起EPCs的ROS水平升高、功能受損，而APN可以降低高糖引起的ROS水平，保護(hù)EPCs的功能；滲透壓對(duì)EPCs無(wú)影響。
[Abstract]:Purpose

Endothelial progenitor cells ( EPCs ) are also referred to as vascular cells , not only in angiogenesis in the embryonic period but also in the repair of vascular neovascularization and endothelial damage after birth . The number of EPCs in patients with diabetes mellitus complicated with cardiovascular complications is reduced , and the function decreases . It can lead to damage of vascular restenosis and repair . Adironin ( APN ) is a fat - derived plasma protein , which has protective effect on cardiovascular diseases . APN has anti - inflammatory and anti - atherosclerosis effects , and can promote angiogenesis ;
In addition , APN can decrease myocardial ischemia - reperfusion injury and inhibit myocardial hypertrophy remodeling by regulating cell metabolism . However , it is not clear whether APN can improve the quantity and function of EPCs in high - sugar environment . However , it is not clear whether APN can improve the quantity and function of EPCs in high - sugar environment .
The effects of APN on the number and function of EPCs after high glucose damage were observed . The possible mechanism of APN was discussed , and the new intervention targets and necessary scientific theories were provided for the clinical treatment of metabolic syndrome .

method

1 . Isolation , culture and identification of EPCs : Human peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation , cultured for 7 days by M199 medium containing basic fibroblast growth factor ( bFGF ) , vascular endothelial growth factor ( VEGF ) and 10 % fetal bovine serum . The morphological , flow cytometry and laser confocal inverted microscope were used to observe the identification of ac - LDL and UEA - I in cultured cells .

2 . Effects of different concentrations of glucose on EPCs : collecting cultured 4d cells , giving different concentrations of glucose ( 5.5 , 20 , 25 , 30 , 50mmol / l ) for 48h , and detecting the proliferative capacity of EPCs by MTT colorimetric assay ;
The apoptosis rate of EPCs was detected by annexin V - FITC method .
Cell reactive oxygen ( ROS ) level was detected by fluorescence probe ( DCFH - DA ) assay .

3 . The effects of APN on EPCs in high glucose environment were divided into 7 groups : 5 . 5mmol / l glucose , 5.5 mmol / l glucose + 24.5 mmol / l mannitol , 30 mmol / l glucose for 96 h . The rest 4 groups were treated with 30 mmol / l glucose for 48 hours . Then , the cells were harvested at 1.25 渭g / ml , 2.5 渭g / ml , 5 渭g / ml and 10 渭g / ml APN for 48 hours .

4 . Statistical treatment : Statistical analysis was carried out with SPSS 10.0 statistical software . The experimental data was expressed by X - ray - 鹵 s , and the data between the groups was ANOVA , P < 0.05 .

Results

1 . EPCs were cultured and identified : the peripheral blood mononuclear cells isolated from the density gradient centrifugation method were round and bright , short fusiform adherent cells appeared after 4 days of culture , and typical cell colonies were observed .
After 7 days of culture , the cell colonies increased obviously , and the spindle - shaped cells grew and grew in cross sex ;
Cell uptake of DiI - acLDL showed red fluorescence , the uptake of FITC - UEA - I was green fluorescence , the uptake of DiI - acLDL and the binding of FITC - UEA - I cells showed yellow fluorescence . The results of flow cytometry showed that the percentage of CD133 and CD34 + cells was 92.32 % , 10.7 % and 23.3 % , respectively .

2 . The effects of different sugar concentrations on EPCs were ( 0.287 鹵 0.031 ) , ( 0.252 鹵 0.034 ) , ( 0.242 鹵 0.019 ) , ( 0.215 鹵 0.081 ) , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) , respectively .
When the concentration of sugar was 30 mmol / l and 50 mmol / l , there was no statistical difference between the two groups ( P0.05 ) .

3 . The effect of APN on EPCs after high glucose was analyzed . The results showed that the proliferation , migration , apoptosis and ROS level of EPCs were significantly higher than those in normal control group ( P0.05 ) .

Conclusion

1 . High glucose intervention can decrease the proliferation ability of EPCs and increase the apoptosis of EPCs .


2 . After high glucose intervention , APN , EPCs proliferation , migration ability recovery , cell apoptosis were reduced , and its effect increased with increasing concentration in a certain range ;


3 . High glucose can raise the level of ROS and function of EPCs , while APN can decrease the level of ROS and protect EPCs .
The osmotic pressure had no effect on EPCs .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1845386