發(fā)布時間：2018-05-03 23:26

  本文選題：人脂肪源性干細(xì)胞 + 誘導(dǎo)�。� 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的： 體外分離培養(yǎng)人脂肪源性干細(xì)胞(human adipose derived stem cells, hADSCs),觀察hADSCs的細(xì)胞形態(tài),檢測hADSCs的生長曲線、表面標(biāo)志物及其在體外的分化潛能,初步探討Insulin、Nestin、CK19在hADSCs分化為胰島素分泌樣細(xì)胞過程中的表達(dá)。 方法： 采用Ⅰ型膠原酶消化法從成人皮下脂肪組織分離培養(yǎng)hADSCs,在倒置顯微鏡下觀察hADSCs的形態(tài)特點和生長特征,用細(xì)胞計數(shù)法繪制hADSCs(P3、P8)的生長曲線,用免疫組織化學(xué)方法檢測波形蛋白,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD44、CD90、CD105的表達(dá)以及觀察hADSCs分化為脂肪樣細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞的潛能,以及通過三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)hADSCs分化為胰島素分泌樣細(xì)胞。首先采用含2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的H-DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)6天,之后用含2-ME、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、B27、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的H-DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)6天,最后用含2-ME、尼克酰胺、B27、BSA的H-DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)6天。對照組細(xì)胞采用含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長特征,對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行雙硫腙染色以及免疫組化檢測Insulin、 Nestin、CK19的表達(dá)。 結(jié)果： 在倒置相差顯微鏡下觀察,新鮮分離的hADSCs在48-72小時貼壁,為成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞傳代后3天內(nèi)處于潛伏期,第4天進(jìn)入生長期,第7天進(jìn)入平臺期。細(xì)胞的增殖能力隨傳代次數(shù)的增加而有所下降,細(xì)胞培養(yǎng)至9代,生長基本停滯,呈老化狀態(tài)。免疫組織化學(xué)方法檢測hADSCs表達(dá)波形蛋白,流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代hADSCs表達(dá)CD34、CD45、CD44、CD90、CD105陽性率分別是1.5%、0.0%、100.0%、98.6%、99.5%。選用P3的hADSCs用于誘導(dǎo)分化試驗hADSCs經(jīng)定向誘導(dǎo)成脂分化后,胞質(zhì)出現(xiàn)脂滴,油紅O染色為陽性hADSCs經(jīng)定向誘導(dǎo)成骨分化后,可見鈣結(jié)節(jié),茜素紅染色為陽性。在誘導(dǎo)hADSCs分化為胰島素分泌樣細(xì)胞的第一階段,在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞部分脫落,存活細(xì)胞的折光性增強(qiáng),形態(tài)未發(fā)生明顯改變,雙硫腙染色為陰性,免疫組織化學(xué)方法檢測Nestin、CK19和Insulin均為陰性表達(dá)。在誘導(dǎo)的第二階段,細(xì)胞大量增殖,部分細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形,雙硫腙染色陰性,免疫組化檢測Nestin為陽性表達(dá),而CK19和Insulin為陰性表達(dá)。在誘導(dǎo)的第三階段,誘導(dǎo)細(xì)胞成團(tuán)聚集,雙硫腙染色陽性,免疫組化檢測Nestin、CK19和Insulin均陰性表達(dá)。對照組染色均為陰性。 結(jié)論： Ⅰ型膠原酶消化法可從成人皮下脂肪組織中分離獲取hADSCs,其具有多向分化潛能；在hADSCs分化為胰島素分泌樣細(xì)胞的過程中有Nestin表達(dá),雙硫腙染色陽性。
[Abstract]:Objective:
The human adipose derived stem cells (human adipose derived stem cells, hADSCs) were isolated and cultured in vitro. The cell morphology of hADSCs was observed, the growth curve of hADSCs, the surface marker and the differentiation potential in vitro were detected, and the expression of Insulin, Nestin, CK19 in the process of differentiation of hADSCs into insulin secreting like cells was preliminarily discussed.
Method錛，

本文編號：1840573