本文選題：日本腦炎病毒 + prME蛋白��； 參考：《生物工程學(xué)報(bào)》2017年05期

【摘要】：應(yīng)用畢赤酵母分泌表達(dá)日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鑒定其表達(dá)效果與免疫原性,以期為JEV亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。RT-PCR擴(kuò)增JEV SA14-14-2株prME基因,將其連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa-A,分別獲得pPICZa-prME和攜帶JEV Cap蛋白C末端19個(gè)Aa信號(hào)肽的pPICZa-SprME質(zhì)粒。表達(dá)載體用PmeⅠ酶切線性化,通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33并誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)。利用SDS-PAGE和Western blotting鑒定酵母發(fā)酵上清中目的蛋白的表達(dá)情況。利用GE蛋白層析純化柱純化目的蛋白,利用電鏡觀察純化前后的目的蛋白,將不同劑量純化后的prME蛋白與弗氏佐劑混合以及定量純化后的prME蛋白與不同劑量的核酸佐劑混合分別免疫4周齡小鼠,定期采血,ELISA檢測(cè)被免小鼠血清的抗體水平,空斑減少試驗(yàn)測(cè)定抗體中和效價(jià)。SDS-PAGE結(jié)果表明畢赤酵母可以分泌表達(dá)完整的prME蛋白,目的蛋白在70 100 kDa之間;Western blotting結(jié)果顯示分泌表達(dá)的prME蛋白具有良好的反應(yīng)原性,進(jìn)一步證明prME蛋白在酵母X33中以整體的形式分泌表達(dá),沒有發(fā)生水解切割。純化目的蛋白,根據(jù)洗脫時(shí)間和體積表明其分子量大于1×10~6 Da,因此推斷prME蛋白可能形成多聚化的顆粒。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)直徑30 50 nm的病毒樣顆粒(Virus like particles,VLPs)。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明,純化后的重組蛋白10 15μg/只接種小鼠在3周后抗體達(dá)到高峰值,之后逐漸下降,免疫7周后小鼠血清仍可檢測(cè)到JEV抗體。將prME VLPs以10μg/只的劑量與不同劑量的核酸佐劑配伍后接種小鼠,ELISA檢測(cè)結(jié)果表明核酸佐劑可明顯增強(qiáng)JEV prME VLPs免疫應(yīng)答,免疫4周后小鼠血清的中和抗體效價(jià)為1∶80 1∶160。上述結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)JEV prME雖不能發(fā)生水解切割,但仍可形成VLP并誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較高水平中和抗體。
[Abstract]:Pichia pastoris was used to secrete and express Japanese encephalitis virus (encephalitis) encephalitis virus JEV PERME protein, to identify its expression and immunogenicity, and to lay a foundation for the preparation of JEV subunit vaccine. RT-PCR was used to amplify the prME gene of JEV SA14-14-2 strain. PPICZa-A was ligated into Pichia pastoris expression vector pPICZa-A, and pPICZa-prME and pPICZa-SprME plasmids carrying 19 AA signal peptides at the C-terminal of JEV Cap protein were obtained, respectively. The expression vector was digested linearly by Pme 鈪，

本文編號(hào)：1824859