發(fā)布時(shí)間：2018-04-20 13:18

  本文選題：樹(shù)突狀細(xì)胞 + 活化后凋亡�。� 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年博士論文

【摘要】：活化后凋亡(activation-induced cell death, AICD)是淋巴細(xì)胞受到外來(lái)或自身抗原刺激后發(fā)生活化、增殖,并行使免疫功能后多數(shù)細(xì)胞的最終歸宿,也是免疫系統(tǒng)負(fù)向調(diào)控的重要環(huán)節(jié),有利于控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和維持免疫耐受。但是活化后凋亡的淋巴細(xì)胞如何誘導(dǎo)免疫負(fù)向調(diào)控還有許多未知之處。多項(xiàng)研究提示正常機(jī)體中靜息的自體細(xì)胞凋亡后,會(huì)被巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)迅速吞噬和清除,并誘導(dǎo)免疫耐受,且這一過(guò)程的缺陷與多種疾病的病因相關(guān)�；罨蟮蛲隽馨图�(xì)胞被清除的過(guò)程和對(duì)巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞的影響尚不清楚。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞中具有不同功能的亞群,能夠正向或負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答。而不同DC亞群可以吞噬處理凋亡細(xì)胞產(chǎn)生不同的生理效應(yīng),能夠誘導(dǎo)免疫耐受,也可促進(jìn)免疫應(yīng)答。前期研究顯示,吞噬自體靜息凋亡細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng),并可能有如下機(jī)制參與其中。吞噬凋亡細(xì)胞使樹(shù)突狀細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子分泌減少,而某些抑制性細(xì)胞因子釋放增多,如IL-10、TGF-β、IDO等;吞噬凋亡細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)的產(chǎn)生,通過(guò)Treg來(lái)負(fù)向調(diào)控免疫反應(yīng)。DC吞噬凋亡細(xì)胞后產(chǎn)生免疫抑制的機(jī)制目前多處于爭(zhēng)論之中。不同的模型可能會(huì)出現(xiàn)不同的效應(yīng)。我們研究組前期采用脾臟基質(zhì)細(xì)胞、腦小膠質(zhì)細(xì)胞和肝基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)DC分化形成DCreg,能夠顯著抑制免疫反應(yīng),其主要的抑制機(jī)制是分泌NO,并且發(fā)現(xiàn)NO對(duì)T細(xì)胞的增殖具有直接抑制作用。因此,我們采用GM-CSF/IL4體外培養(yǎng)的小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞和經(jīng)抗原刺激后發(fā)生凋亡的CD4+ T細(xì)胞為模型展開(kāi)研究,旨在(一)探討在免疫應(yīng)答過(guò)程中,吞噬活化后凋亡淋巴細(xì)胞的DC是否能夠形成調(diào)節(jié)性DC,對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生負(fù)向調(diào)控作用;(二)這種吞噬凋亡細(xì)胞的DC是否分泌NO,其濃度是否能夠?qū)細(xì)胞活化、增殖及功能產(chǎn)生抑制效應(yīng),以及DC產(chǎn)生NO的機(jī)制,。 我們用體外培養(yǎng)的成熟的C57BL/6小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞作為提呈細(xì)胞,在OVA323 339多肽存在的情況下,刺激經(jīng)磁珠分離純化的TCR轉(zhuǎn)基因CD4+ T細(xì)胞(DO11.10×C57BL/6 F1小鼠)。CD4+ T細(xì)胞活化后約96小時(shí),即有大量細(xì)胞出現(xiàn)活化后凋亡。我們采用熒光染色,流式細(xì)胞檢測(cè)和透射電鏡等方法驗(yàn)證了CD4+ T細(xì)胞的凋亡。將DC與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)以上,獲得吞噬凋亡細(xì)胞的DC(DCapo),并采用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡來(lái)證實(shí)DC對(duì)凋亡細(xì)胞和凋亡小體的吞噬作用。用流式細(xì)胞分析對(duì)mDC和DCapo進(jìn)行表型和吞噬功能的比較發(fā)現(xiàn),經(jīng)凋亡淋巴細(xì)胞處理后,DCapo的CD11c、MHC II類(lèi)分子和CD40、CD80、CD86共刺激分子的表達(dá)明顯下降,而CD11b的表達(dá)上升。細(xì)胞的吞噬功能也增強(qiáng),與不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞類(lèi)似。以上結(jié)果顯示,DC在體外能夠吞噬活化后凋亡的淋巴細(xì)胞,其生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生顯著變化。 我們?cè)隗w外采用抗原提呈系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)DCapo的抗原提呈功能及是否具有免疫抑制效應(yīng)。在mDC刺激特異性CD4+或CD8+ T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中,加入DCapo,用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)T細(xì)胞的數(shù)量和CFSE分裂峰,評(píng)價(jià)CD4+或CD8+ T細(xì)胞的活化和增殖情況。結(jié)果顯示mDC能夠顯著刺激T細(xì)胞的增殖和分裂,而DCapo本身刺激T細(xì)胞增殖分裂的能力則很弱。DCapo能夠顯著抑制mDC刺激引起的的CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增殖和分裂。我們將新鮮MACS分選的帶有OVA特異性CD4+或CD8+ T細(xì)胞過(guò)繼性回輸?shù)绞荏w小鼠體內(nèi),然后再回輸已經(jīng)荷載抗原肽的mDC和/或DCapo刺激其增殖,觀察DCapo在體內(nèi)對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)的作用。在回輸3-4天后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血和脾臟抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量和CFSE分裂峰,結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)類(lèi)似,DCapo在體內(nèi)也表現(xiàn)為對(duì)CD4+和CD8+ T細(xì)胞增殖的強(qiáng)烈抑制作用。 然后,我們探討了DCapo發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn),吞噬了凋亡淋巴細(xì)胞的DC分泌大量的NO。先前的研究證實(shí)NO可以直接抑制CD4+ T細(xì)胞的增殖效應(yīng)。我們?cè)隗w外DCapo抑制mDC刺激抗原特異性的CD4+ T細(xì)胞的增殖分裂的實(shí)驗(yàn)體系中,分別加用NO供體(NOC-18)和NO拮抗劑(PBIT),培養(yǎng)4天后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)在mDC刺激T細(xì)胞增殖組加用NO供體后能夠顯著抑制T細(xì)胞的增殖分裂。而在DCapo抑制mDC刺激T細(xì)胞增殖組中添加NO拮抗劑,DCapo對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用能得到很大程度的逆轉(zhuǎn)。這一結(jié)果說(shuō)明NO在DCapo的免疫抑制作用中發(fā)揮了重要作用。DCapo可以通過(guò)NO直接抑制T細(xì)胞反應(yīng),但是DCapo是否還誘導(dǎo)Treg來(lái)間接抑制T細(xì)胞反應(yīng)呢?為了分析DCapo的抑制作用是否與Treg有關(guān),我們利用同時(shí)有Foxp3EGFP和DO11.10特異性TCR的雜交一代小鼠T細(xì)胞,來(lái)替換體外DCapo抑制mDC刺激的抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的抗原特異性T細(xì)胞,觀察體外DCapo是否可以促進(jìn)Foxp3EGFPCD4+ T細(xì)胞的增加或Treg參與其抑制作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例的變化,結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組間Treg比例并沒(méi)有顯著性差異。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),活化后凋亡細(xì)胞、DCapo體內(nèi)回輸與PBS對(duì)照組間小鼠外周血的CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例也沒(méi)有顯著增加。結(jié)果表明,抗原信號(hào)誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化后死亡所誘發(fā)的調(diào)節(jié)性DC的免疫抑制作用不是通過(guò)誘導(dǎo)Treg來(lái)產(chǎn)生的。 既然DCapo能夠通過(guò)NO來(lái)發(fā)揮直接抑制免疫反應(yīng)的作用,那么DCapo是如何產(chǎn)生NO的呢?與凋亡細(xì)胞的作用是否有關(guān)呢?細(xì)胞凋亡的早期就有磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)暴露在細(xì)胞膜表面,是樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別凋亡細(xì)胞的重要分子。研究提示凋亡細(xì)胞膜表面的PS與DC表面的受體結(jié)合后可以激活STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而STAT3不僅是胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,同時(shí)也是轉(zhuǎn)錄激活因子。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示在正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞,STAT3的激活可以促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞表面分子的表達(dá),包括IL-6, IL-10, TGF-β等等。這些細(xì)胞因子常常與DC的負(fù)向調(diào)控功能有關(guān)。而STAT3的活化是否和NO的釋放有關(guān)目前尚不明確。 我們的研究結(jié)果表明,經(jīng)抗原信號(hào)刺激產(chǎn)生的凋亡T細(xì)胞能誘導(dǎo)DC細(xì)胞分泌NO,而NO是DCapo發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的重要分子。因此我們?cè)噲D分析活化后凋亡的淋巴細(xì)胞是否也能夠使DC胞內(nèi)的STAT3磷酸化,其活化是否與NO的生成有直接關(guān)系。我們采用Western Blot的方法對(duì)DCapo胞內(nèi)的STAT3信號(hào)分子進(jìn)行了蛋白檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),DCapo胞內(nèi)p-STAT3的表達(dá)也隨之增強(qiáng),從而增強(qiáng)了STAT3的轉(zhuǎn)錄活性。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),iNOS的表達(dá)也逐漸上升,其趨勢(shì)與p-STAT3一致,而且iNOS的蛋白表達(dá)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平均可以被特異性p-STAT3抑制劑JSI-124所抑制。對(duì)DCapo分泌NO的檢測(cè)也證實(shí),JSI-124有抑制DCapo分泌NO的作用。以上結(jié)果說(shuō)明活化后凋亡淋巴細(xì)胞對(duì)DCapo的誘導(dǎo)與DC胞內(nèi)的STAT3信號(hào)通路相關(guān),STAT3的磷酸化與iNOS的產(chǎn)生有很強(qiáng)的相關(guān)性。 本課題研究發(fā)現(xiàn),將活化后凋亡的淋巴細(xì)胞與DC細(xì)胞共培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)出調(diào)節(jié)性DC(DCapo),其CD11c、MHC II類(lèi)分子和共刺激分子的表達(dá)明顯下降,CD11b的表達(dá)上升,吞噬功能增強(qiáng),同時(shí)能夠顯著抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖和分裂,符合調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞的特點(diǎn);DCapo主要通過(guò)分泌NO來(lái)抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖,未能發(fā)現(xiàn)DCapo誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生或Treg參與DCapo的抑制作用;活化后凋亡淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)DCapo的分子機(jī)制與STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化相關(guān),并且STAT3的活化導(dǎo)致iNOS的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),使的NO的分泌增加,NO直接參與了DCapo的免疫抑制機(jī)制。這些結(jié)果證實(shí)吞噬了活化后凋亡淋巴細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞是一群具有免疫抑制表型和功能的調(diào)節(jié)性DC細(xì)胞,NO是其發(fā)揮免疫抑制作用的重要分子,活化后凋亡淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的DCapo胞內(nèi)STAT3活化與iNOS的合成和NO分泌相關(guān)。我們研究的結(jié)果進(jìn)一步闡明了活化后凋亡淋巴細(xì)胞對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的作用,并有助于解釋了活化后凋亡誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。
[Abstract]:Activation - induced cell death ( AICD ) is an important link in the activation , proliferation and immune tolerance of lymphocytes after activation and proliferation .

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本文編號(hào)：1777922