本文選題：斯氏貍殖吸蟲 + 線粒體基因　； 參考：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的：擴(kuò)增出斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb (cytochrome B)基因片段并測序,研究斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因在囊蚴期、30天幼蟲期、60天童蟲期、成蟲期和蟲卵期5個(gè)蟲期的表達(dá)情況,分析該基因?qū)ξx遺傳分類、蟲期物質(zhì)代謝及致病方面的意義。方法：(1)提取斯氏貍殖吸蟲成蟲基因組DNA,同時(shí)分別提取斯氏貍殖吸蟲5個(gè)蟲期的mRNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA�；蚪MDNA和各蟲期cDNA保存于-20℃。(2)用日本血吸蟲線粒體cytb基因設(shè)計(jì)出斯氏貍殖吸蟲的線粒體cytb基因的兼并引物,擴(kuò)增出蟲體囊蚴的總DNA,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法擴(kuò)增出斯氏貍殖吸蟲cytb基因片段→電泳分離→提純→連接→轉(zhuǎn)化→挑菌→搖菌→送出測序。用所得的測序結(jié)果設(shè)計(jì)斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段的特異引物。(3) Blast與斯氏貍殖吸蟲cytb有親緣性的吸蟲,并用DNAsis等軟件分析這些吸蟲的線粒體cytb基因,然后用樹的方式表達(dá)它們的親緣關(guān)系。(4)以5個(gè)蟲期的cDNA為模板,特異引物為實(shí)驗(yàn)組引物,衛(wèi)氏貍殖吸蟲的18SrDNA基因引物作為內(nèi)參引物做實(shí)時(shí)熒光定量PCR (realtime PCR)。根據(jù)所獲得的結(jié)果判斷斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因分別在5個(gè)蟲期的表達(dá)情況并分析其意義。結(jié)果：(1)獲得542bp的斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段,并將該基因片段納入NCBI基因庫中。根據(jù)該基因片段設(shè)計(jì)出一對(duì)斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段的特異引物CytbF:5'GGTTGCTTGATCATAACATTGG3'CytbR:5GACACTCTGGGTCGACCTTG5'(2)通過在Genebank數(shù)據(jù)庫中Blast發(fā)現(xiàn),斯氏貍殖吸蟲的此段cytb序列與日本血吸蟲(中國流行區(qū)蟲種)、異盤并殖吸蟲、哈氏并殖吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲以及斜睪吸蟲等有相似性,一共搜索到種7種具有同源性的蟲種,對(duì)這7種吸蟲線粒體cytb序列利用MEGA4計(jì)算遺傳距離,采用最大簡約法(MP)和鄰位相連法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap法檢驗(yàn),并用Clusterx軟件對(duì)7種吸蟲線粒體cytb序列進(jìn)行多序列對(duì)比。結(jié)果顯示,用NJ和MP方法構(gòu)建的遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似,同時(shí)用MEGA4軟件對(duì)遺傳距離進(jìn)行分析計(jì)算上,所得遺傳距離遠(yuǎn)近分布與所得遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果一致。(3) Realtime PCR結(jié)果顯示除了蟲卵期不見線粒體cytb基因的表達(dá),其他蟲期均有表達(dá)。結(jié)論：1.線粒體cytb基因可作為吸蟲遺傳進(jìn)化分類的依據(jù)。2.線粒體cytb基因在斯氏貍殖吸蟲不同蟲期的表達(dá)情況與不同時(shí)期該蟲對(duì)宿主的侵襲危害是成正相關(guān)的,也為以后的預(yù)防,診斷,治療提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Objective: to amplify and sequence the mitochondrial Cytb gene of paragonimus skrjabini, and study the expression of mitochondrial cytb gene of P. skrjabini in 5 stages of larval stage, adult stage and egg stage of P. skrjabini in 30 days larval stage, 60 days larval stage, and 5 stages of egg stage.The significance of the gene in genetic classification, substance metabolism and pathogenicity of trematodes was analyzed.Methods Genomic DNA was extracted from adult P. skrjabini and mRNAs from 5 stages of paragonimus skrjabini were extracted and reversely transcribed as cDNA.Genomic DNA and cDNA were stored at -20 鈩，

本文編號(hào)：1771688