本文選題：內皮祖細胞 + 微囊蛋白-l�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：創(chuàng)傷會導致機體的靶細胞嚴重損傷，同時由于感染所致的膿毒癥及非感染所致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)相互作用使得自體修復功能障礙，并進一步造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，從而引起重要臟器功能障礙，這可能就是多器官功能障礙(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)的始發(fā)環(huán)節(jié)。而MODS是重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的最常見原因。 內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓及其它組織被動員到外周血進行損傷的修復。內皮祖細胞又稱為血管母細胞(angioblast)，既參與出生后的血管生成(angiogenesis，AG)，同時亦參與機體、器官損傷后的血管再生與修復。1997年，Asahara等首次證明循環(huán)外周血中存在能分化為血管內皮細胞的前體細胞，并將其命名為血管內皮祖細胞。近年來的研究顯示，內皮祖細胞是參與出生后生理性及病理性血管形成最主要的細胞，同時可以在體內分化為內皮細胞，并參與心、肝、腎等單個器官損傷或器官衰竭時的修復。因此，內皮祖細胞在創(chuàng)傷后缺血性疾病和創(chuàng)傷修復等過程中的具有重要治療作用和廣闊的臨床應用前景。 微囊蛋白(Caveolin)，又稱小窩蛋白，為小窩最主要組成蛋白，屬整合膜蛋白。微囊蛋白家族包括Caveolin-1，Caveolin-2，Caveolin-3，其主要的作用是把細胞外的生物活性分子向胞內轉移，并在胞內運輸并參與多種信號的接收和轉運，其生理功能主要表現(xiàn)在維持細胞進出平衡，參與細胞增殖、遷移和信號傳遞。微囊蛋白-l（Caveolin-1）是其主要組成蛋白，能直接與多種信號分子如G蛋白a亞單位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成員(Src，F(xiàn)yn等)、EGF受體、胰島素受體、PKC、eNOS等連接，從而調控這些信號分子的活性狀態(tài)。Tan Zh等研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以通過提高Caveolin-1的表達從而促進EPC的增殖和分化，同時Caveolin-1的表達強度和EPC的功能密切相關。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1是體內信號轉導通路的樞紐，可以能直接與多種信號分子如G蛋白a亞單位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成員等連接，調控這些信號分子的活性狀態(tài)。有研究顯示：通過藥物干預或剔除Caveolin-1可使PI3K表達下降，用β-環(huán)糊精抑制Caveolin-1可阻止PI3K活化。活化的PI3K可以激活其下游的信號轉導通路磷脂酰肌醇激酶-3/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/內皮型一氧化氮合成酶（PI3K/Akt/eNOS），而該信號通路下游的內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的完整與否直接影響到EPC的動員、增殖和分化；而無論是PI3K/Akt/eNOS通路上游的磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Akt）；還是下游的eNOS的效應子一氧化氮（NO）對EPC的動員、遷徙及血管形成功能都有非常重要的調節(jié)功能。Everaert研究發(fā)現(xiàn)，PI3K的活化能使其下游的Akt磷酸化，磷酸化的Akt可直接磷酸化eNOS，導致eNOS被激活，誘導血管內皮大量合成NO。NO可以通過作用于金屬基質蛋白-9（mmp-9）促進EPC的動員、遷徙和血管形成功能，并可滅活細胞凋亡的關鍵酶caspase-3和caspase-6等，從多條途徑抑制EPC和血管內皮細胞凋亡。 本研究通過從不同組織（外周血、骨髓、臍血和臍帶）中成功分離培養(yǎng)出內皮祖細胞，并在體外模擬缺血、缺因子環(huán)境下培養(yǎng)EPC，使EPC受損，觀察EPC表面Caveolin-1的表達與EPC功能的關系，并在EPC體外培養(yǎng)體系中，利用RNA干擾技術調控Caveolin-1的表達強度，以及嘗試阻斷Caveolin-1信號轉導通路PI3K/Akt/eNOS，觀察EPC功能的變化。以明確Caveolin-1與EPC功能的相關性及其調控作用機制，從信號轉導通路的角度進一步研究MODS的發(fā)生和發(fā)展機制，并通過改善創(chuàng)傷后內皮祖細胞功能，為有效防治MODS提供確實的理論依據(jù)和實驗基礎，并為臨床創(chuàng)傷后MODS的有效防治提供新的方法。 第一部分不同組織來源的人內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：從不同組織中分離培養(yǎng)內皮祖細胞，并對比不同組織來源的內皮祖細胞功能的優(yōu)劣，從而挑選出組織來源方便及功能優(yōu)良的內皮祖細胞，為最終能夠獲得用于細胞移植或組織工程的種子細胞提供基礎。 方法：采用密度梯度差速貼壁培養(yǎng)法及組織塊植塊法，分別從外周血、骨髓、臍帶血及臍帶組織中分離培養(yǎng)內皮祖細胞，結合細胞形態(tài)學特征、細胞的超微結構、細胞免疫表型、乙�；牡兔芏戎鞍祝―il-Ac-LDL)和荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1）的吞噬功能、體外血管生成功能進行鑒定，并對比不同組織來源的內皮祖細胞功能的優(yōu)劣。 結果：除外周血來源的細胞不能增殖傳代，從骨髓、臍帶血及臍帶組織中均能成功分離培養(yǎng)并擴增內皮祖細胞，骨髓來源的內皮祖細胞連續(xù)傳4代以上，細胞形態(tài)發(fā)生改變，而臍帶血及臍帶組織來源的內皮祖細胞可穩(wěn)定傳10代以上，細胞形態(tài)無明顯改變。細胞呈集落樣生長，繼而增殖加速，周邊出現(xiàn)梭狀分化細胞，培養(yǎng)至約20天以后，出現(xiàn)了內皮細胞樣的“鋪路石”狀，同時電鏡觀察細胞發(fā)現(xiàn)有內皮細胞特有的特征性的Weibel-Palade小體存在，符合內皮祖細胞的形態(tài)特點；流式細胞儀檢測細胞表型發(fā)現(xiàn)，三種組織來源的內皮祖細胞都表達CD133、CD34、CD31和KDR，CD133和CD34的表達隨培養(yǎng)時間增加逐漸下降，而CD31和KDR的表達隨時間增加而升高；雙吞噬功能鑒定發(fā)現(xiàn)超過85%體外培養(yǎng)的貼壁細胞都特異性地攝取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1；體外血管形成實驗顯示：三種組織來源的內皮祖細胞均具有血管形成能力。對比三者的功能后發(fā)現(xiàn)，臍帶及臍帶血來源的內皮祖細胞較骨髓來源的內皮祖細胞，無論是穩(wěn)定維持祖細胞的特性，還是增殖能力及成血管能力都較強。且按照每根臍帶中位長30cm計算，原代平均可獲得大量的內皮祖細胞（約1.51×l07個）。結論：從骨髓、臍帶血及臍帶組織中能成功分離培養(yǎng)出內皮祖細胞，并能傳代擴增。臍帶來源的內皮祖細胞形態(tài)學特征及功能與臍血來源的相似，無論是穩(wěn)定維持祖細胞的特性，還是增殖能力及成血管能力相對于骨髓來源的內皮祖細胞來說都較強。且按照每根臍帶中位長30cm計算，原代平均可獲得大量的內皮祖細胞（約1.51×l07個），且培養(yǎng)方法簡便、可靠。為最終能夠獲得用于細胞移植或者組織工程的種子細胞的臨床應用做準備。 第二部分微囊蛋白-l的表達與內皮祖細胞功能的相關性研究目的：證明內皮祖細胞功能受損時與其表面的微囊蛋白-l（Caveolin-1）的表達變化密切相關。 方法：采用無血清無因子培養(yǎng)法，在體外使臍帶來源的內皮祖細胞受損，檢測其增殖和血管形成能力等功能變化及其表面微囊蛋白-l的表達。再通過RNA干擾技術抑制內皮祖細胞表面微囊蛋白-l的表達后，檢測其增殖能力和血管形成能力等功能變化。 結果：無血清無因子培養(yǎng)法可以誘導內皮祖細胞損傷凋亡，且隨時間延長，凋亡增加，并且其血管形成能力也顯著降低，其表面Caveolin-1的表達較正常組顯著下降(P＜0.01)，并且隨著內皮祖細胞損傷的加重，Caveolin-1的表達逐漸降低。說明內皮祖細胞的功能變化與其表面Caveolin-1的表達相關。利用RNA干擾技術成功抑制臍帶來源的內皮祖細胞Caveolin-1的表達后，Caveolin-1RNA干擾組細胞增殖能力明顯下降(P＜0.05)，且細胞的血管形成能力也明顯下降。結果表明，抑制Caveolin-1mRNA的表達，可以抑制內皮祖細胞的生長和血管形成等功能。 結論：當內皮祖細胞受損時，其生長及血管形成能力降低等功能變化與其表面Caveolin-1的表達密切相關。抑制內皮祖細胞Caveolin-1mRNA的表達后，內皮祖細胞的增殖能力和血管形成能力顯著下降。從而說明了內皮祖細胞表面Caveolin-1的表達可以調控其功能。通過正向調控Caveolin-1可以改善創(chuàng)傷后內皮祖細胞的功能，從而為有效防治多器官障礙提供確實的理論依據(jù)和實驗基礎。 第三部分微囊蛋白-l對內皮祖細胞功能調控的機制探討 目的：探討Caveolin-1是否通過PI3K/Akt/eNOS信號轉導通路調節(jié)內皮祖細胞功能的變化。 方法：在內皮祖細胞體外培養(yǎng)體系中，分別利用Caveolin-1、PI3K和Akt特異性抑制劑β-環(huán)糊精、LY294002和triciribine阻斷信號轉導通路后，觀察該信號轉導通路的下游產物磷酸化Akt蛋白和NO(間接反映eNOS)的表達情況及內皮祖細胞的生長和血管形成等功能變化，以證實Caveolin-1是否通過PI3K/Akt/eNOS信號轉導通路調節(jié)內皮祖細胞功能的變化。 結果：β-環(huán)糊精、LY294002抑制Caveolin-1和PI3K后，，其下游的磷酸化Akt蛋白和NO(間接反映eNOS)表達均減少，加之triciribine抑制Akt后，eNOS表達減少，說明β-環(huán)糊精阻斷Caveolin-1后，通過阻止PI3K活化來抑制Akt磷酸化，進而影響eNOS的活化造成NO產生減少。三組抑制組細胞與對照組相比，其細胞增殖能力和成血管能力都明顯下降（P＜0.05），說明了Caveolin-1通過PI3K/Akt/eNOS通路可調節(jié)內皮祖細胞的功能。當然，Caveolin-1可能還通過其它通路來調節(jié)內皮祖細胞的功能，這就需要我們更進一步的研究。 結論：當內皮祖細胞受損時，其表面Caveolin-1表達降低，細胞增殖能力和成血管能力隨之下降。內皮祖細胞表面的Caveolin-1表達減少，影響了PI3K的活化，使Akt磷酸化減少造成eNOS的活化減少，進而NO產生減少，導致內皮祖細胞的增殖能力和成血管能力等功能下降，進而影響機體修復。 總之，當某些疾�。ㄈ缛毖�(chuàng)傷、甚至MODS）造成內皮祖細胞受損時，內皮祖細胞表面的Caveolin-1表達減少，影響了PI3K的活化，使Akt磷酸化減少造成eNOS的活化減少，進而NO產生減少，導致內皮祖細胞的增殖能力和成血管能力等功能下降，進而影響機體修復。這一結論為我們從信號轉導通路的角度進一步研究MODS的發(fā)生和發(fā)展機制，并通過改善創(chuàng)傷后內皮祖細胞功能，為有效防治MODS提供確實的理論依據(jù)和實驗基礎，并為臨床創(chuàng)傷后MODS的有效防治提供新的方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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