本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞 + 胰腺損傷　； 參考：《華中科技大學》2012年博士論文

【摘要】：研究目的 1.探討B(tài)MSCs在胰腺損傷修復中的作用 2.探討B(tài)MSCs在慢性胰腺炎纖維化中的作用 3.探討MicroRNA是否可以作為CP-PDAC過程中標志物 研究方法 1.建立C57/BL6小鼠胰腺損傷模型(65%～70%胰腺部分切除),通過尾靜脈注射表達綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的小鼠BMSCs (GFP+ BMSCs的表面標志用流式細胞術檢測,成脂和成骨分化能力用相應的成脂和成骨培養(yǎng)基誘導檢測),應用GFP免疫組織化學技術分析BMSCs在損傷胰腺中的遷移與分布；運用胰腺導管上皮標志CK-19,胰島p細胞標志Insulin,胰腺星狀細胞標志Desmin和α-SMA,血管內(nèi)皮細胞表面標志CD31和神經(jīng)細胞標志Nestin與GFP免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術分析胰腺組織中BMSCs的表型,并統(tǒng)計GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+, GFP+/Nestin+亞群所占比例；用電子秤稱量手術四周后的小鼠體重和胰腺重量,計算胰腺／體重比；將四周后的小鼠胰腺消化為單細胞懸液,用流式細胞術分選出GFP+的細胞。用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測分選出的GFP+的細胞,野生型(Wild type) BMSCs和GFP+ BMSCs中4種MicroRNA (miR-9, miR-204, miR-375和miR-34a)的表達。接受GFP+ BMSCs注射的正常小鼠和不接受GFP+ BMSCs注射的胰腺損傷小鼠作為對照。 2.建立C57/BL6小鼠慢性胰腺炎模型(蛙皮素誘導8周),通過尾靜脈注射GFP+小鼠BMSCs(表面標志和成脂成骨能力檢測同前),應用GFP免疫組織化學技術分析BMSCs在纖維化胰腺中的遷移與分布；運用胰腺星狀細胞標志Desmin和α-SMA, MMP-2和MMP-9與GFP免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術分析胰腺組織中BMSCs的表型,并統(tǒng)計GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+亞群所占比例；用天狼星紅(Sirius red)染色和Image Pro Plus軟件檢測胰腺組織的纖維化程度；用Western blotting技術檢測胰腺組織中MMP-9和MMP-2的表達水平。不接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎胰腺小鼠作為對照。 3.建立大鼠慢性胰腺炎-胰腺癌(CP-PDAC)模型：將大鼠胰膽管部分結扎(75%),8周內(nèi)形成慢性胰腺炎,然后在大鼠胰腺內(nèi)包埋二甲基苯并葸(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)粉末,三個月內(nèi)形成胰腺癌。只包埋DMBA的大鼠作為對照組。在不同時間點取大鼠模型的胰腺標本,用qRT-PCR檢測不同病變程度胰腺中相關MicroRNA (miR-34a,miR-204, miR-107和miR-21)的表達,比較MicroRNA在正常胰腺,不同程度纖維化胰腺,PanINs病變和PDAC中的表達差異。 實驗結果 1.免疫組化的結果顯示GFP廣泛表達于損傷胰腺的實質(zhì)和間質(zhì)中,其中導管結構中有18.5±3.3%,血管結構中有23.4±5.6%,腺泡結構中有3.4±1.5%,胰島結構中沒有,其它間質(zhì)中有54.7±8.9%。免疫熒光雙染共聚焦技術顯示GFP+BMSCs分化為胰腺導管上皮細胞(占1.7±0.3%),胰腺星狀細胞(占5.2±1.6%),血管內(nèi)皮細胞(占3.2±0.6%),沒有發(fā)現(xiàn)其分化為胰島細胞和神經(jīng)細胞。損傷胰腺中的GFP+ BMSCs和其分化的細胞遠多于正常胰腺。對于部分切除胰腺的小鼠,接受GFP+ BMSCs注射的小鼠的胰腺重量／體重比((0.225±0.042)%)高于未接受GFP+ BMSCs注射的小鼠((0.183±0.021)%)(p0.05)。另外,實時定量PCR的結果顯示miR-9和miR-204在定植于胰腺的BMSCs中的表達高于野生型BMSCs和GFP+ BMSCs(分別為5.2-fold和2.6-fold, p0.05)。miR-375在定植于胰腺的BMSCs中表達降低(0.71-fold, p0.05),而niR-34a的表達沒有明顯改變。 2.HE染色顯示蛙皮素處理8周后出現(xiàn)典型慢性胰腺炎特征,免疫組化的結果顯示GFP廣泛表達于纖維化胰腺的實質(zhì)和間質(zhì)中,免疫熒光雙染共聚焦技術顯示GFP+BMSCs分化為胰腺星狀細胞(GFP+/Desmin+和GFP+/α-SMA+)(占7.5±2.3%),部分GFP+BMSCs表達MMP-2和MMP-9。Image Pro Plus軟件檢測天狼星紅染色的胰腺切片,發(fā)現(xiàn)接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠的纖維化面積占4.56%±0.63%,小于未接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠(7.37%±0.92%, P 0.05)。Western blotting結果顯示接受BMSCs處理的胰腺組織中MMP-2和MMP-9的表達高于未接受BMSCs處理的胰腺組織。 3.實時熒光定量PCR結果顯示：相對于慢性胰腺炎大鼠胰腺,miR-34a在PanIN-1, PanIN-2, PanIN-3和PDAC病變組織中表達顯著升高(p0.05),miR-204在PanIN-2, PanIN-3和PDAC病變組織中表達顯著降低(p0.05),miR-21在PanIN-3和PDAC病變組織中表達顯著升高(p0.05),而miR-107只在PDAC病變組織中表達升高(p0.05)。 實驗結論 1.外周血中的BMSCs能遷移到損傷的胰腺中,并能通過分化為胰腺導管細胞,血管內(nèi)皮細胞和胰腺星狀細胞參與胰腺的損傷修復,促進胰腺再生。miR-9, miR-204和miR-375可能參與BMSCs在胰腺中的分化過程。 2.外周血中的BMSCs能遷移到纖維化的胰腺中,能通過表達MMP-2和MMP-9降低胰腺的纖維化程度,同時也能分化為胰腺星狀細胞參與纖維化形成過程。 3. miR-34a和miR-204能早期鑒別大鼠的慢性胰腺炎與PanINs病變,可能參與胰腺癌的早期癌變過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R-332

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本文編號：1740305