本文選題：體外沖擊波　切入點(diǎn)：破骨細(xì)胞　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:健康骨骼處于成骨細(xì)胞(osteoblast, OB)骨形成與破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)骨吸收動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài),這種平衡一旦被打破可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(osteoporosis)、骨硬化病(osteopetrosis)等多種骨代謝性疾病。力學(xué)刺激在調(diào)節(jié)骨骼重塑和維持骨量方面具有重要的作用,以往研究已證明有效力學(xué)刺激能促進(jìn)成骨。破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞,它由來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞譜系(monocyte/macrophage lineage),通過(guò)多個(gè)單核的祖細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞。力學(xué)刺激對(duì)破骨細(xì)胞形成和活性的影響研究少見(jiàn)。 體外沖擊波(Extracorporeal Shock Wave,ESW)是由壓力瞬間急劇變化產(chǎn)生的一種機(jī)械波,它產(chǎn)生的能量可經(jīng)相應(yīng)儀器二次聚焦形成高能量沖擊波,產(chǎn)生治療作用。體外沖擊波具有可定量作用于治療部位、無(wú)創(chuàng)、并發(fā)癥少、治療周期短、風(fēng)險(xiǎn)低等許多優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)適宜能量的沖擊波可以增加成骨細(xì)胞的成骨活性,進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。但沖擊波作為一種能量刺激形式,對(duì)破骨細(xì)胞的形成及骨吸收活性的影響,目前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有相關(guān)研究。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將體外沖擊波作用于成骨細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)體系,模擬破骨細(xì)胞在體內(nèi)與成骨細(xì)胞相互作用的環(huán)境,通過(guò)觀察破骨細(xì)胞形成過(guò)程中的形態(tài)變化、RT-PCR分析形成過(guò)程中調(diào)控基因的表達(dá)水平、ELISA檢測(cè)破骨細(xì)胞特異性蛋白分泌水平及電鏡下定量分析其骨吸收能力,探討沖擊波對(duì)破骨細(xì)胞形成及骨吸收作用的影響。 方法: 1骨髓血分離hMSCs及成骨誘導(dǎo):選擇10名志愿者(排除代謝性疾病),各抽取骨髓20ml,梯度離心法獲得hMSCs,常規(guī)培養(yǎng)1周后獲得大量hMSCs,采用經(jīng)典成骨培養(yǎng)基(10nM地塞米松、50uM抗壞血酸、10mMβ-甘油磷酸鈉)經(jīng)4周誘導(dǎo),獲得成骨細(xì)胞,ALP染色、茜素紅染色驗(yàn)證成骨細(xì)胞活性。 2成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立:10名志愿者再次骨髓穿刺獲得骨髓血20ml,密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells, BMMCs)。將BMMCs加入預(yù)先放置骨片的懸掛式培養(yǎng)皿,培養(yǎng)液中加入0.1μM的1,25(OH)2VD3為破骨誘導(dǎo)劑。由此建立底層為成骨細(xì)胞,上層為破骨細(xì)胞,大分子能相互影響的共培養(yǎng)系統(tǒng)。 3體外沖擊波對(duì)共培養(yǎng)系中破骨細(xì)胞的作用:BMMCs貼壁后12小時(shí),使用500頻次0.12mJ/mm2的體外沖擊波對(duì)培養(yǎng)系進(jìn)行干預(yù),在光鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化,培養(yǎng)一周后ELISA法分析檢測(cè)培養(yǎng)液中組織蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b、白細(xì)胞介素1β,腫瘤壞死因子α的含量,RT-PCR分析破骨細(xì)胞RANK,NFATc1和c-Fos表達(dá)水平,行TRAP染色,定量分析ESW對(duì)破骨細(xì)胞形態(tài)及融合的影響,骨片電鏡掃描分析骨陷窩數(shù)量及面積。以單個(gè)核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)ESW干預(yù)組,單獨(dú)培養(yǎng)組及共培養(yǎng)非干預(yù)組組為對(duì)照。對(duì)所有數(shù)據(jù)x±s表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,方差分析比較其差異,設(shè)定P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)28天后,經(jīng)ALP和茜素紅染色,可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié),證明已獲得高活性成骨細(xì)胞。加入單個(gè)核細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系后,各組單個(gè)核細(xì)胞在1-3天都可見(jiàn)聚集趨勢(shì),聚集密度2-10個(gè)不等,但此時(shí)仍可見(jiàn)細(xì)胞膜完整,未發(fā)生融合。4-6天可見(jiàn)細(xì)胞逐漸融合,形成2-6個(gè)核不等的多個(gè)核巨細(xì)胞。經(jīng)ESW干預(yù)組與未干預(yù)組相比,細(xì)胞融合發(fā)生較晚,融合后形成的細(xì)胞核數(shù)量較少。 2 ELISA法檢測(cè)破骨細(xì)胞特異性蛋白分泌水平,共培養(yǎng)干預(yù)組組織蛋白酶K 2.23±0.35ng/ml,TRAP 5b 1.53±0.29ng/ml,IL1β53.28±7.45 ng/ml,TNFα5.87±0.80ng/ml,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)明顯低于非ESW干預(yù)組,但高于BMMC單獨(dú)培養(yǎng)ESW干預(yù)組(P0.05),顯示共培養(yǎng)中成骨細(xì)胞分泌的相關(guān)因子促進(jìn)了破骨細(xì)胞特異性蛋白的分泌,但ESW對(duì)這些蛋白的分泌有抑制作用。RT-PCR檢測(cè)RANK,NFATc1和c-Fos基因表達(dá)水平,沖擊波干預(yù)組熒光亮度低于未干預(yù)組,證明沖擊波抑制了破骨細(xì)胞形成過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)。 3培養(yǎng)后的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)TRAP染色,各組細(xì)胞均被染為酒紅色,證明各組均表達(dá)特異性抗酒石酸酸性磷酸酶,所產(chǎn)生的細(xì)胞為破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞融合指數(shù)ESW干預(yù)共培養(yǎng)組為0.46±0.10,未干預(yù)組為0.73±0.14,兩者間有顯著性差異,證明ESW抑制了共培養(yǎng)系中BMMC的融合(P0.05)。掃描電鏡分析骨陷窩面積,ESW干預(yù)共培養(yǎng)組為12963±952μm2,未干預(yù)組為16257±1423μm2,兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。證明ESW干預(yù)后破骨細(xì)胞骨吸收能力降低。 結(jié)論: 1采用成骨細(xì)胞及BMMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)可建立人成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,可獲得足夠破骨細(xì)胞用于體外研究。 2在共培養(yǎng)系中,成骨細(xì)胞具有促進(jìn)BMMCs融合生成破骨細(xì)胞的作用。 3 ESW可有效抑制共培養(yǎng)系中破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因表達(dá)、特異性蛋白分泌、抑制其骨吸收能力,ESW對(duì)破骨細(xì)胞的形成及活性具有明顯的抑制作用。
[Abstract]:Objective : To study the dynamic balance of bone resorption in osteoblasts ( OB ) and osteopetrosis , which can lead to osteoporosis , osteopetrosis and other bone metabolic diseases .

The extracorporeal shock wave is a kind of mechanical wave produced by the rapid change of pressure . The energy generated by it can form high energy shock wave through the secondary focusing of the corresponding instrument . The extracorporeal shock wave has many advantages , such as treatment site , non - invasive , few complications , short treatment period and low risk . The experimental study finds that the shock wave of suitable energy can increase the osteogenic activity of osteoblasts and promote the healing of fracture .

In this experiment , the effects of shock wave on the formation and bone resorption of osteoblasts were investigated by observing the morphological changes in the formation of osteoblasts and the expression level of the regulatory genes in the formation of osteoblasts by observing the morphological changes in the process of formation and the quantitative analysis of the bone resorption ability by ELISA .

Method :

hMSCs were isolated from bone marrow and induced by bone formation : 10 volunteers ( excluding metabolic diseases ) were selected , 20 ml of bone marrow were extracted , and hMSCs were obtained by gradient centrifugation . After 1 week of routine culture , a large amount of hMSCs were obtained . After 1 week of routine culture , a large amount of hMSCs were obtained . Osteoblasts , ALP staining and alizarin red staining were used to verify the activity of osteoblasts .

Bone marrow mononuclear cells ( BMMCs ) were obtained from bone marrow mononuclear cells ( BMMCs ) by density gradient centrifugation . BMMCs were added to a suspension culture dish in which bone fragments were pre - placed . 0.1 . m u.M of 1 , 25 ( OH ) 2VD3 was added to the culture solution to break the bone inducing agent .

3 In vitro shock wave was used to observe the effect of culture system in the co - culture system : 12 hours after the BMMCs were applied , the culture system was observed with 500 frequency of 0.12 mJ / mm2 . After a week of culture , the levels of tissue proteinase K , anti - tartrate acid phosphatase 5b , interleukin 1 尾 and tumor necrosis factor 偽 were observed under light microscope .

Results :

After bone marrow mesenchymal stem cells were cultured for 28 days , ALP and alizarin red staining , calcium nodules were observed to show that high - activity osteoblasts were obtained . After addition of mononuclear cells to establish the co - culture system , the cells of each group showed a tendency of aggregation in 1 - 3 days .

2 . The level of specific protein secretion was detected by ELISA . The tissue proteinase K 2 . 23 鹵 0 . 35ng / ml , TRAP 5b 1 . 53 鹵 0 . 29ng / ml , IL - 1尾 53.28 鹵 7.45 ng / ml , IL - 1尾 53.28 鹵 7.45 ng / ml , TNF - 偽 were 5.87 鹵 0.80 ng / ml .

All the cells were stained red with TRAP staining , and the cells were stained red to prove that the specific anti - tartrate acid phosphatase was expressed in each group . There was significant difference between the two groups ( P 0.05 ) . The difference between the two groups was 12963 鹵 95渭m 2 , and 16257 鹵 1423渭m in the untreated group . The difference between the two groups was statistically significant ( P0.05 ) .

Conclusion :

1 . Osteoblasts were cultured in vitro and cultured with BMMCs to establish the co - culture system of human osteoblasts and Osteoclasts , which can be used for in vitro study .

2 In the co - culture system , the osteoblast has the function of promoting the fusion of BMMCs to form the broken cell .

3 . The expression of related genes , specific protein secretion and inhibition of bone resorption in the co - culture system can be effectively inhibited in the co - culture system .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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