本文選題：Treg　切入點(diǎn)：組蛋白修飾　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：研究背景及目的: 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells, Treg)在自身免疫耐受和免疫自穩(wěn)中起著非常關(guān)鍵的作用,其在胸腺內(nèi)發(fā)育成為一類獨(dú)立的CD4~+T細(xì)胞亞群。許多研究結(jié)果都觀察到表觀遺傳調(diào)控對(duì)于控制Treg細(xì)胞基因特別是Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子3(the forkhead/winged- helix protein 3, FOXP3)的表達(dá)起到很關(guān)鍵的作用。Treg細(xì)胞和普通的T細(xì)胞相比,FOXP3基因不同區(qū)域的DNA甲基化和特異性的組蛋白修飾方式是不同的。但是目前的研究主要還是集中在DNA的甲基化是如何調(diào)控Treg基因的表達(dá),關(guān)于組蛋白修飾,特別是與啟動(dòng)子相關(guān)的H3K4me3修飾(trimethylated histone H3 lysine 4)和與增強(qiáng)子相關(guān)的H3K4me1修飾(monomethylated histone H3 lysine 4),對(duì)于Treg細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用研究很少。因此,本研究擬采用ChIP-Seq的技術(shù),繪制并比較Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me3和H3K4me1修飾的全基因組圖譜,從而對(duì)H3K4me3和H3K4me1這兩種修飾在Treg細(xì)胞基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步的探討。 實(shí)驗(yàn)方法: 一、人CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增和純化: 1.人CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的分離和純度檢測(cè):用磁珠分選(magnetic-activated cell-sorting, MACS)的方法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中分離CD4~+CD25~+T細(xì)胞;用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)的方法檢測(cè)分選后細(xì)胞的純度; 2.人CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增與純度檢測(cè):用Invitrogen公司人Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增;用FCM的方法檢測(cè)擴(kuò)增過程中FOXP3~+細(xì)胞的純度; 3.擴(kuò)增后細(xì)胞的抑制功能檢測(cè):擴(kuò)增后細(xì)胞與CFSE(5-and-6 carboxy fluoresceindiacetate succinimidyl ester)標(biāo)記的CD4~+CD25-T細(xì)胞不同比例混合(0:1, 1:1, 1:2, 1:4), FCM檢測(cè)CD4~+CD25-T細(xì)胞的增殖情況; 4.擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選:用CD4、CD25和FOXP3三個(gè)標(biāo)記對(duì)擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting, FACS) ,分選出CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg細(xì)胞和CD4~+CD25~+FOXP3-T(aTconv)細(xì)胞。 二、H3K4me3和H3K4me1在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中的作用: 1.染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation, ChIP)及高通量測(cè)序前后已知位點(diǎn)的實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR, QPCR)檢測(cè):用抗H3K4me3抗體和抗H3K4me1抗體及其陰性對(duì)照抗體IgG對(duì)擴(kuò)增后的Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞進(jìn)行ChIP;用ChIP-QPCR的方法對(duì)選取的陽(yáng)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),我們選取了部分與Treg細(xì)胞功能相關(guān)基因的啟動(dòng)子或者H3K4me1位點(diǎn)作為陽(yáng)性位點(diǎn),例如FOXP3,白介素2受體α(interleukin 2 receptor alpha, IL2RA),糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR),細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte -associated antigen-4, CTLA-4),趨化因子受體7(chemokine (C-Cmotif) receptor 7, CCR7)以及信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)家族; 2.ChIP樣本的高通量測(cè)序(high-throughput sequencing)及生物信息學(xué)分析:將ChIP DNA樣本送往深圳華大基因研究所,使用Solexa 1G Genome Analyzer高通量側(cè)測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序;用比對(duì)軟件SOAP(short oligonucleotide analysis package)將測(cè)序數(shù)據(jù)與人類基因組序列進(jìn)行比對(duì),獲得唯一比對(duì)的reads;用MACS(Model-based Analysis for ChIP-Seq)方法進(jìn)行全基因組peaks的掃描,獲得H3K4me3 peaks和H3K4me1 peaks; 3.Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞的H3K4me3和H3K4me1修飾的全基因組圖譜及其比較:人類基因組分為四個(gè)部分,即近端啟動(dòng)子區(qū)(proximal promoters)、外顯子區(qū)(exons)、內(nèi)含子區(qū)(introns)、基因間區(qū)(intergenic sequences),統(tǒng)計(jì)Peaks在這些區(qū)域分布的比例;通過生物信息學(xué)鑒定Treg細(xì)胞或者aTconv細(xì)胞之間共有的或者特異性的H3K4me3 peaks、H3K4me1 peaks、H3K4me3 proximal promoters以及proximal promoters相關(guān)基因; 4.Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞特異性或者共有基因的H3K4me3和H3K4me1修飾特征:選取與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因,例如FOXP3, IL2RA, CTLA4、TNFRSF18、STAT家族和CCR7等,將ChIP-Seq數(shù)據(jù)在UCSC Genome Browser以圖形化的方式展示,比較這些基因H3K4me3和H3K4me1的修飾特征;用QPCR的方法鑒定這些基因在這兩類細(xì)胞之間的mRNA表達(dá)水平差異; 5.Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞特異性或者共有的H3K4me1位點(diǎn)的功能鑒定:運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)證實(shí)候選的H3K4me1片段是否具有增強(qiáng)子的活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 第一部分:人CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增和純化 1.MACS的方法從PBMC中分離了CD4~+CD25~+T細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4~+CD25~+T細(xì)胞的純度為93.7%; 2.用Invitrogen公司商品化的人CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒對(duì)MACS分選的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增70天后,細(xì)胞絕對(duì)數(shù)擴(kuò)大了1000倍以上;但是在細(xì)胞擴(kuò)增的整個(gè)過程中,我們通過CD4、CD25和FOXP3這三個(gè)標(biāo)志進(jìn)行Treg細(xì)胞純度的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的不斷增加,CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg細(xì)胞的純度不斷降低; 3.CFSE標(biāo)記的CD4~+CD25-T細(xì)胞與體外擴(kuò)增的CD4~+CD25~+T細(xì)胞分別按1:0, 1:1, 2:1, 4:1比例混合,在CD3抗體與CD28抗體聯(lián)合作用下,刺激7天后進(jìn)行流式檢測(cè),發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增后的CD4~+CD25~+T細(xì)胞可以有效的抑制CD4~+CD25-T細(xì)胞的增殖; 4.用CD4、CD25和FOXP3這個(gè)三個(gè)標(biāo)志,對(duì)擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選,最終我們得到了2×106個(gè)純度為99%的CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg細(xì)胞以及1×107個(gè)純度為99.4%的CD4~+CD25~+FOXP3-T細(xì)胞,我們將其分別命名為Treg細(xì)胞和活化的普通T細(xì)胞(active conventional T cells, aTconv)。 第二部分:H3K4me3在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中作用 1.高通量測(cè)序前通過對(duì)已知位點(diǎn)的QPCR檢測(cè),結(jié)果顯示:已知基因的啟動(dòng)子區(qū)域,在Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞中都會(huì)被H3K4me3高度修飾,而在陰性對(duì)照組IgG中,幾乎不發(fā)生H3K4me3的富集;但是FOXP3基因的啟動(dòng)子區(qū)域例外,結(jié)果顯示僅僅Treg細(xì)胞中會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的H3K4me3修飾,在aTconv細(xì)胞和陰性對(duì)照組中,沒有富集。這些結(jié)果與理論是一致的,從而保證了樣品的可靠性; 2.ChIP樣品送往深圳華大基因研究所進(jìn)行高通量測(cè)序,經(jīng)過生物信息學(xué)分析,得到了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me3的全基因組圖譜; 3.運(yùn)用生物信息學(xué)的方法首先從整體上比較了兩樣品的H3K4me3 peaks,發(fā)現(xiàn):peaks的相關(guān)系數(shù)為0.92且共有的peaks數(shù)目為20784;然后比較了兩類細(xì)胞之間的H3K4me3 proximal promoters,發(fā)現(xiàn)promoters的相關(guān)系數(shù)為0.83且有15508個(gè)共有的proximal promoters;最后比較了H3K4me3 proximal promoters相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)絕大部分的基因是共有基因,只有1220個(gè)Treg細(xì)胞特異性的基因,這其中就包括Treg細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3; 4.選取了與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因,例如FOXP3, IL2RA, CTLA,腫瘤壞死因子受體超家族成員18(tumor necrosis factor receptor superfamily member 18, TNFRSF18), STAT家族和CCR7,通過UCSC Genome Browser圖形化展示,發(fā)現(xiàn):IL2RA, CTLA4, TNFRSF18和STATs這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域,不管是在Treg細(xì)胞還是aTconv細(xì)胞,都發(fā)生了比較強(qiáng)烈的H3K4me3修飾。但是FOXP3和CCR7基因啟動(dòng)子區(qū)域,只有在Treg細(xì)胞才發(fā)生了強(qiáng)烈的H3K4me3修飾,而在aTconv細(xì)胞中卻沒有;mRNA的表達(dá)水平與H3K4me3在啟動(dòng)子區(qū)域的修飾程度一致。 第三部分:H3K4me1在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中的作用 1.高通量測(cè)序后通過對(duì)已知位點(diǎn)的QPCR檢測(cè),結(jié)果顯示:在Treg細(xì)胞或者aTconv細(xì)胞的已知位點(diǎn),會(huì)發(fā)生比較比較強(qiáng)烈的H3K4me1富集,但在陰性對(duì)照組中,則幾乎不發(fā)生H3K4me1的富集,驗(yàn)證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性; 2.ChIP樣品送往深圳華大基因研究所進(jìn)行高通量測(cè)序,經(jīng)過生物信息學(xué)分析,得到了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me1的全基因組圖譜; 3.運(yùn)用生物信息學(xué)的方法首先從整體上比較了兩樣品的H3K4me1 peaks,發(fā)現(xiàn):peaks的相關(guān)系數(shù)為0.48且在總共115391個(gè)H3K4me1 peaks中只有8897個(gè)共有的peaks; 4.選取了與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因,例如FOXP3, IL2RA, CTLA及TNFRSF18,通過UCSC Genome Browser圖形化展示發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn):Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞之間,這些基因座上的H3K4me1修飾是差別明顯的,但也存在少許的共有H3K4me1位點(diǎn); 5.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)H3K4me1位點(diǎn)進(jìn)行功能鑒定,發(fā)現(xiàn)5個(gè)候選的H3K4me1位點(diǎn)中,只有2個(gè)在Jurkat細(xì)胞中有增強(qiáng)子的活性,而另外3個(gè)則沒有明顯的增強(qiáng)子活性;同時(shí)也發(fā)現(xiàn),有2個(gè)Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞共有的H3K4me1位點(diǎn),在Jurkat細(xì)胞都顯示了明顯的增強(qiáng)子活性; 6.通過生物信息學(xué)比較,發(fā)現(xiàn):Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞中,H3K4me1 peaks和H3K4me3 peaks的相關(guān)性分別為0.16和0.19;同時(shí)還發(fā)發(fā)現(xiàn),在Treg細(xì)胞中,僅僅有5030個(gè)位點(diǎn)是同時(shí)被H3K4me1和H3K4me3修飾,而在aTconv細(xì)胞中,也僅僅有7063個(gè)位點(diǎn)被同時(shí)修飾。 結(jié)論: 1.本研究采用MACS~+FACS的方法得到了足夠數(shù)量并且極高純度的Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞,從而為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了非常堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),也為關(guān)于Treg細(xì)胞的其他方面研究建立了一個(gè)非常好的平臺(tái); 2.我們首次繪制并比較了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me3修飾的全基因組圖譜,發(fā)現(xiàn)這兩類細(xì)胞間H3K4me3修飾,特別是位于近端啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3修飾,變化不大;但是在某些Treg細(xì)胞特異性或者高表達(dá)的基因(例如FOXP3和CCR7)的啟動(dòng)子上,H3K4me3修飾卻只發(fā)生在Treg細(xì)胞上。QPCR結(jié)果顯示mRNA的表達(dá)水平與H3K4m3在啟動(dòng)子上的修飾程度一致。這些結(jié)果提示我們:表觀遺傳可能通過調(diào)節(jié)啟動(dòng)子區(qū)域的H3K4me3修飾水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞基因的表達(dá),換句話說H3K4me3可以通過調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞基因的表達(dá)。 3.我們首次繪制并比較了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me1修飾的全基因組圖譜。結(jié)果顯示,全基因組范圍內(nèi)的H3K4me1修飾,在這兩類細(xì)胞之間區(qū)別巨大;體外實(shí)驗(yàn)證明某些Treg細(xì)胞特異性的H3K4me1位點(diǎn)具有增強(qiáng)子的活性。這一點(diǎn)暗示H3K4me1標(biāo)記的增強(qiáng)子可能是Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞之間變化最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件,其對(duì)于Treg細(xì)胞特異性的基因表達(dá)調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。換句話說,H3K4me1可以通過修飾增強(qiáng)子位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞基因的表達(dá),其可能才是導(dǎo)致Treg細(xì)胞特異性的基因表達(dá)方式的主要原因。 4.我們運(yùn)用生物信息學(xué)的方法比較了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞中,H3K4me1 peaks和H3K4me3 peaks的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)絕大部分具有潛在調(diào)節(jié)功能的H3K4me1位點(diǎn)缺乏H3K4me3修飾。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)H3K4me3或H3K4me1可以通過修飾啟動(dòng)子或增強(qiáng)子來(lái)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞基因的表達(dá),這對(duì)于Treg細(xì)胞的分化、譜系形成以及特異性的基因表達(dá)方式,起著非常重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬錚;王如文;;Foxp3基因與自身免疫性疾病[J];免疫學(xué)雜志;2008年01期

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本文編號(hào)：1677642