本文選題：足細(xì)胞　切入點(diǎn)：細(xì)胞骨架　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：觀察α-actinins基因敲低及突變后足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化及對足細(xì)胞運(yùn)動性和牽拉力的影響。 方法：體外培養(yǎng)條件永生化的野生型及α-actinin-4K256E基因雜合和純合突變型足細(xì)胞。利用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)敲低野生型足細(xì)胞中α-actinin-1和α-actinin-4的表達(dá)；應(yīng)用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果；免疫熒光觀察細(xì)胞形態(tài),α-actinins及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin的分布變化；傷口愈合實(shí)驗(yàn)用于檢測細(xì)胞的運(yùn)動性；牽拉力學(xué)顯微鏡用于檢測細(xì)胞的牽拉力。 結(jié)果：Western Blot結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染小干擾RNA技術(shù)可高效敲低α-actinin-1和α-actinin-4基因。α-Actinin-1和α-actinin-4基因敲低后,細(xì)胞骨架出現(xiàn)紊亂,細(xì)胞的牽拉力增加,而且細(xì)胞的運(yùn)動性也增加。相反,α-actinin-4突變型的足細(xì)胞表現(xiàn)為牽拉力下降,運(yùn)動性降低。 結(jié)論：α-Actinins參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排和牽拉力形成,可調(diào)節(jié)足細(xì)胞的收縮力和限制細(xì)胞的運(yùn)動性。α-Actinin-4突變的足細(xì)胞可獲得某些功能而降低了細(xì)胞的牽拉力和運(yùn)動性。這表明α-actinins功能的改變可能通過改變足細(xì)胞的牽拉力和運(yùn)動性造成腎小球損傷。 目的：觀察體內(nèi)外α-actinins基因敲低及突變后對細(xì)胞間黏附分子vinculin和β3integrin mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 方法：間接免疫熒光法檢測α-actinin-1和α-actinin-4敲低后vinculin, F-actin的表達(dá)分布變化,及活性β3integrin在野生型,α-actinin-4基因敲除,及α-actinin-4K256E基因雜合和純合突變型小鼠中的表達(dá)變化。實(shí)時定量PCR及Western Blot檢測vinculin在α-actinins基因敲低及突變型足細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。另外,實(shí)時定量PCR也檢測了β3integrin在上述幾種細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：Vinculin在α-actinin-4基因敲低足細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平均有增高,但在α-actinin-1基因敲低和α-actinin-4突變足細(xì)胞中表達(dá)無明顯變化。β3Integrin在α-actinin-4突變型足細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平明顯下降。在α-actinin-4基因敲除小鼠腎組織中,活性(33integrin表達(dá)增加,而在α-actinin-4雜合型和純合型突變的小鼠腎組織中,活性(33integrin的表達(dá)下降。 結(jié)論：α-Actinin-4敲低可影響vinculin的表達(dá),而α-actinin-4基因敲除和突變可明顯影響小鼠腎臟活性β3integrin的表達(dá)。這表明α-actinins可影響足細(xì)胞黏著斑的表達(dá)。 目的：觀察α-actinins基因敲低及突變后對小GTP酶活性的影響,同時觀察野生型,α-actinin-4K256E基因雜合和純合突變小鼠腎臟中小GTP酶活性的變化。 方法：利用小GTP酶活性試劑盒檢測α-actinins基因敲低及突變型足細(xì)胞中RhoA, Racl和Cdc42的活性,并同時檢測野生型,α-actinin-4基因雜合及純合型突變小鼠腎臟裂解液中上述三種小GTP酶的活性。 結(jié)果：在α-actinin-4基因敲低細(xì)胞中,RhoA活性顯著下降,Cdc42的活性明顯增高,而Racl活性則無明顯變化。在α-actinin-1基因敲低細(xì)胞中,RhoA活性也有所增加,Racl和Cdc42活性則無變化。在α-actinin-4基因突變細(xì)胞中,雜合型和純合型α-actinin-4細(xì)胞中RhoA舌性均有所增加,而Racl和Cdc42活性則無變化。同時純合型α-actinin-4突變小鼠腎臟中EhoA活性也有所增加,而Racl和Cdc42舌性則無明顯變化。 結(jié)論：α-Actinins基因敲低及突變可不同程度的影響小GTP酶中各種分子的活性。這些小GTP酶活性的變化與足細(xì)胞骨架重排,黏附和遷移都有密切關(guān)系。
[Abstract]:Objective: To observe the changes of the cytoskeleton structure of the podocytes after the knockout of the alpha -actinins gene and the effect on the motility and traction of the podocytes.
Methods: in vitro immortalized wild-type and alpha -actinin-4K256E gene heterozygous and homozygous mutant podocytes. Knockdown of wild-type podocytes and alpha -actinin-1 alpha -actinin-4 using lentiviral transfection of RNA interference technology; application of Western Blot to detect the transfection effect; the cell morphology was observed by immunofluorescence, -actinins and alpha distribution the cytoskeletal structure of F-actin; wound healing experiment for motion detection of cells; mechanical stretch microscope for tension detection cells.
Results: Western Blot showed that lentiviral transfection of small interfering RNA can efficiently knockdown of alpha -actinin-1 and alpha -actinin-4 alpha and alpha -Actinin-1 gene. -actinin-4 gene knockdown, cytoskeleton disorder, tension cells increased, and the movement of cells also increased. On the contrary, the podocyte alpha -actinin-4 mutant showed pulling down, moving down.
Conclusion: alpha -Actinins involved in cytoskeletal rearrangement and stretch formation movement can regulate podocyte contractility and limit cell. Alpha -Actinin-4 mutant podocytes can obtain certain functions and reduce the cell traction force and motion. This shows that changing the alpha -actinins function may cause glomerular injury by changing the foot cell traction force and motion.
Objective: To observe the effect of alpha -actinins gene knockout and mutation on the expression of vinculin and beta 3integrin mRNA and protein expression of intercellular adhesion molecules in vivo and in vitro
Methods: indirect immunofluorescence detection of alpha -actinin-1 alpha and -actinin-4 knockdown of vinculin expression in the distribution of F-actin, and the activity of 3integrin in wild-type alpha beta, -actinin-4 gene knockout, and alpha -actinin-4K256E gene heterozygous and homozygous mutant mice the expression of PCR and Western. Real time quantitative Blot detection in vinculin alpha -actinins gene knockdown the expression and mutation of mRNA and protein changes in podocytes. In addition, quantitative real-time PCR to detect the expression changes of mRNA in these cells in beta 3integrin.
Results: Vinculin -actinin-4 gene knock in alpha levels were increased mRNA and protein expression of low enough cells, but in the alpha -actinin-1 gene knockdown and alpha -actinin-4 mutation in podocytes showed no significant change. 3Integrin mRNA in beta alpha -actinin-4 mutant podocytes expression level decreased significantly. In alpha knockout of -actinin-4 gene in renal tissue in mice, the activity (increase the expression of 33integrin, while in alpha -actinin-4 heterozygous and homozygous mutant mice kidney tissue, activity (decreased the expression of 33integrin.
Conclusion: the knockdown of alpha -Actinin-4 can affect the expression of vinculin, while the knockout and mutation of alpha -actinin-4 can significantly affect the expression of beta 3integrin in mice kidney activity. This indicates that alpha -actinins can affect the expression of adhesion cells in podocyte.
Objective: To observe the effect of alpha -actinins knockdown and mutation on the activity of small GTP enzyme, and observe the change of small GTP enzyme activity in kidney of wild type, -actinin-4K256E gene heterozygous and homozygous mutant mice.
Methods: the activity of RhoA, Racl and Cdc42 in alpha -actinins knockdown and mutant podocytes was detected by small GTP enzyme activity kit, and the activities of the above three small GTP enzymes in the kidney lysate of wild type, alpha -actinin-4 gene heterozygous and homozygous mutant mice were detected simultaneously.
Results: in the alpha -actinin-4 gene knockdown cells, RhoA activity decreased significantly, the activity of Cdc42 increased significantly, while the Racl activity did not change significantly. In the alpha -actinin-1 gene knockdown cells, RhoA activity also increased, no change of Racl and the activity of Cdc42. -actinin-4 gene mutation in alpha cells, increased RhoA the tongue of both heterozygous and homozygous alpha -actinin-4 cells, while Racl and Cdc42 activity did not change. At the same time the homozygous alpha -actinin-4 mutant mice kidney EhoA activity also increased, while the Racl and Cdc42 of the tongue had no obvious change.
Conclusion: the knockdown and mutation of -Actinins gene can influence the activities of various molecules in small GTP enzymes to varying degrees. These small GTP activities are closely related to the rearrangement, adhesion and migration of podocyte.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：1646281