本文選題：人乳頭瘤病毒　切入點(diǎn)：次要衣殼蛋白　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一種嗜黏膜和皮膚上皮的雙鏈DNA病毒,屬于乳頭瘤病毒科,乳頭瘤病毒屬。HPV感染與多種疾病的發(fā)生相關(guān),根據(jù)致病性將其分為高危型和低危型2種,高危型感染與宮頸癌及癌前病變的發(fā)生密切相關(guān),有：HPV-16、-18、-45、-31、-33、-52、-58等；其中70%的宮頸癌與HPV-16/18型有關(guān)。低危型感染與生殖器疣和宮頸低級(jí)鱗狀上皮增生病變的發(fā)生密切相關(guān),有：HPV-6、-11、-40、-42等,其中6和11型的感染與90%以上的生殖器疣和宮頸低級(jí)鱗狀上皮增生病變的發(fā)生密切相關(guān)。大量研究證實(shí)HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。隨著病因?qū)W研究的深入,以病原學(xué)為基礎(chǔ)的HPV預(yù)防性疫苗的研發(fā)成為熱點(diǎn),到90年代后期取得了突破性進(jìn)展,2006年終于成功上市。目前兩種可用的預(yù)防性HPV疫苗的抗原都是由重組的HPV Ll衣殼蛋白組成的VLPs。四價(jià)疫苗(Gardasil)由Merch Co.生產(chǎn),含有酵母表達(dá)的HPV-6,HPV-11, HPV-16, HPV-18四種VLPs。二價(jià)疫苗(Cervarix)是由GSK生產(chǎn)含有昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的HPV-16, HPV-18兩種VLP蛋白。大量的臨床試驗(yàn)已經(jīng)表明這兩種疫苗都有良好的耐受性、免疫原性和有效地抗HPV感染和宮頸癌前病變。如果廣泛使用目前針對(duì)HPV-16和HPV-18的HPV疫苗,將會(huì)極大地降低宮頸癌的發(fā)生率。然而,約83%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,全球?qū)嵤┈F(xiàn)在許可的疫苗花費(fèi)太高,而不能使最需要使用疫苗的人群受益。并且,宮頸癌還有約30%是不在現(xiàn)有的HPV疫苗的保護(hù)之列。因此,價(jià)格低廉、廣譜的新型預(yù)防性HPV疫苗的研發(fā)對(duì)HPV感染相關(guān)疾病的預(yù)防起著至關(guān)重要的作用。L2作為HPV的次要衣殼蛋白,雖然不是形成衣殼所必須的,但已有諸多研究表明其N端可誘發(fā)產(chǎn)生具有交義中和活性的抗體。本試驗(yàn)的主要研究目的就是以L2蛋白為靶抗原,探索研制一種低廉、廣譜的HPV預(yù)防性疫苗。本論文的設(shè)計(jì)思路是：根據(jù)流行病學(xué)資料選擇主要流行型別,高危型HPV-16,-18,-58型；低危型HPV-6,-11型,將各型別L2 N端具有交叉中和活性的區(qū)域作為靶抗原,以高危型和低危型分為兩組將對(duì)應(yīng)基因串聯(lián),構(gòu)建三價(jià)和二價(jià)融合基因片段。在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)純化三價(jià)、二價(jià)融合蛋白,評(píng)價(jià)其誘發(fā)中和抗體和交叉中和抗體的能力。期望在此基礎(chǔ)之上構(gòu)建能夠誘發(fā)強(qiáng)的的廣譜交叉中和抗體的五價(jià)融合蛋白,為研制具有廣譜交叉中和保護(hù)能力、價(jià)格低廉的HPV預(yù)防性疫苗做一些前期的探索。主要研究結(jié)果如下：第一、構(gòu)建了HPV低危型HPV-6,-11不同表位排列組合的二價(jià)融合的原核表達(dá)質(zhì)粒三個(gè)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21(DE3+)菌在IPTG誘導(dǎo)下能表達(dá)相應(yīng)分子量的目的蛋白,經(jīng)Western-Blot鑒定正確。將純化的純度在90%以上的三種二價(jià)融合蛋白分別與A1(OH)3佐劑混合免疫雌性BALB/c小鼠。用ELISA和基于假病毒的體外中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫效果。ELISA結(jié)果顯示,三種不同長(zhǎng)度的HPV-6/11型L2二價(jià)融合蛋白有特異性ⅠgG抗體產(chǎn)生,同型別滴度在1：10000-1：200000之間,交叉ⅠgG滴度為1：3200到1：51200之間。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)于HPV-6,HPV-11假病毒顆粒,滴度在1：400到1：800之間,而假病毒HVP-16,-18,-45,-52,-58也有不同程度的中和滴度,最高可達(dá)1：800。第二、將低危型HPV-6/11(11-88氨基酸/11-88氨基酸)二價(jià)融合蛋白與本室已經(jīng)構(gòu)建好的高危型HPV-18/16/58(11-200氨基酸/11-150氨基酸/11-150氨基酸)三價(jià)融合蛋白混合免疫。ELISA結(jié)果顯示,混合免疫產(chǎn)生的特異性ⅠgG抗體,滴度都在1：10000-1：200000之間。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,同型中和滴度都在1：400到1：3200之間,交叉中和抗體HPV45和HPV52分別為1：800,1：400。將篩選出的低危型HPV-6/11(11-88氨基酸/11-88氨基酸)二種型別融合基因片段與本室已構(gòu)建好的高危型HPV-18/16/58三種型別基因片段列串聯(lián)構(gòu)建五種型別融合的原核表達(dá)質(zhì)粒二個(gè)。一個(gè)是高危型(pET-HPV 18/16/58/6/11)在N端,一個(gè)是低危型(pET-HPV 6/11/18/16/58)在N端。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21(DE3+)菌在IPTG誘導(dǎo)下能表達(dá)相應(yīng)分子量的目的蛋白,經(jīng)Western-Blot鑒定正確。將純化的純度在90%以上的兩種五價(jià)融合蛋白分別與Al(OH)3佐劑混合免疫雌性小鼠。用ELISA和基于假病毒的體外中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫效果。ELISA結(jié)果顯示,二者的ⅠgG抗體滴度都在1：51200到1：204800之間。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,蛋白HPV-6/11/16/18/58針對(duì)同型別除了HPV11的中和抗體滴度為1：800之外其它的中和抗體滴度為1：6400,而對(duì)于交叉型別HPV-45, HPV-52的中和滴度都是1：3200。比單獨(dú)二價(jià)(HPV6/11)、三價(jià)(HPV-18/16/58)及二價(jià)、三價(jià)混合免疫產(chǎn)生的中和抗體滴度都高,就本研究所能檢測(cè)人HVP各型別中和抗體滴度而言,蛋白HPV-18/16/58/6/11誘發(fā)產(chǎn)生的交叉中和抗體比蛋白HPV-6/11/18/16/58高。綜上所述,本研究篩選出的兩種低危型HPV L2基因片段串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白能夠誘發(fā)針對(duì)同型別的中和抗體,及較低滴度的交叉中和抗體。將該基因片段與三價(jià)高危型HPV融合基因片段串聯(lián)構(gòu)建表達(dá)的五種基因型HPV融合蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)同型別除了HPV11的中和抗體滴度為1：800之外其它的中和抗體滴度為1：6400,而對(duì)于交叉型別HPV-45,HPV-52的中和滴度都是1:3200。這為研發(fā)具有廣譜交叉中和活性的新型HPV疫苗,提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊春燕;李少偉;王晉;魏e，

本文編號(hào)：1643121