本文選題：日本血吸蟲(chóng)　切入點(diǎn)：抗原　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，全球七十四個(gè)流行國(guó)家中至今仍有約七億人口受到血吸蟲(chóng)病威脅，兩億人口受到血吸蟲(chóng)病感染，其中有兩千萬(wàn)人有較重的臨床癥狀并伴有不同程度的勞動(dòng)力喪失，且每年至少還有兩萬(wàn)人死于血吸蟲(chóng)病。在我國(guó)流行的是日本血吸蟲(chóng)病，雖然經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的努力，血吸蟲(chóng)病的流行程度已大大減低。但是，至2010年底，在全國(guó)七個(gè)流行省份的92個(gè)縣中仍有三十余萬(wàn)的血吸蟲(chóng)病患者。因此，血吸蟲(chóng)病的防治和研究工作仍然面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。 作為一種危害嚴(yán)重的多細(xì)胞寄生蠕蟲(chóng)，日本血吸蟲(chóng)侵入宿主機(jī)體后可引發(fā)復(fù)雜的免疫應(yīng)答。隨著對(duì)日本血吸蟲(chóng)免疫學(xué)研究的不斷深入，人類正在一層層揭開(kāi)日本血吸蟲(chóng)與其適宜宿主人類之間關(guān)系的面紗。大量研究已歸納出日本血吸蟲(chóng)感染后宿主免疫應(yīng)答的特征，即感染后最初的2-4周，宿主在移行中的童蟲(chóng)刺激下，呈現(xiàn)Th1型(IFN-g，TNF)優(yōu)勢(shì)應(yīng)答；一旦成蟲(chóng)開(kāi)始產(chǎn)卵，Th1型應(yīng)答迅速下降，并持續(xù)呈現(xiàn)出Th2型（IL-4，IL-13，IL-10，IL-5）優(yōu)勢(shì)應(yīng)答�？梢�(jiàn)蟲(chóng)卵抗原產(chǎn)生前后，宿主體內(nèi)的細(xì)胞因子微環(huán)境也因此發(fā)生了變化。但到目前為止，對(duì)這一免疫現(xiàn)象背后更為深入的免疫機(jī)制還未被完全闡明。由此，繼續(xù)探索這一免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機(jī)制，從而通過(guò)人工調(diào)節(jié)，使免疫應(yīng)答向著有利于人體的方向發(fā)展就顯得極為重要。 巨噬細(xì)胞在人類免疫系統(tǒng)中占有獨(dú)特的位置，其是免疫系統(tǒng)第一個(gè)被確定的細(xì)胞成分,在機(jī)體正常生理過(guò)程和病理過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，在不同的環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以分化為行使特定免疫角色的不同細(xì)胞亞群。在不同微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞主要分為兩種類型：M1型，即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage)，其可直接吞噬和殺傷病原微生物和腫瘤細(xì)胞，分泌促炎因子和趨化因子，并通過(guò)遞呈抗原參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能； M2型，即替代性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activatedmacrophage)。其可在M-CSF、 IL-4、 IL-13、 IL-10、糖皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、維生素D3和前列腺素E2(PGE2)等作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生，其抗原遞呈能力較低，并通過(guò)分泌IL-10、 CCL17、 CCL18、 CCL22和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子下調(diào)免疫應(yīng)答。根據(jù)固有免疫參與并調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，和影響特異性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度與類型，以及抗原刺激啟動(dòng)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵在于Mφ和DC等固有免疫細(xì)胞作用的認(rèn)知，研究在血吸蟲(chóng)感染中固有免疫細(xì)胞與抗原相互作用可能發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)影響應(yīng)是理所當(dāng)然的關(guān)注重點(diǎn)。鑒于Mφ是血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫炎癥中的主要細(xì)胞成分，而血吸蟲(chóng)感染全過(guò)程的宿主免疫應(yīng)答經(jīng)歷了由I型（Th1）向II型（Th2）的漂移，漂移的結(jié)點(diǎn)正好是以成蟲(chóng)產(chǎn)卵為界，提示了Mφ在此過(guò)程中可能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能并推論：通過(guò)成蟲(chóng)產(chǎn)卵前后抗原微環(huán)境的劇烈改變，從而誘導(dǎo)Mφ極化分型來(lái)指導(dǎo)和/或調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答類型。本研究以這一設(shè)想作為我們關(guān)注的重點(diǎn)，通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明血吸蟲(chóng)抗原刺激和巨噬細(xì)胞極化的相互關(guān)系，并探明Mφ極化分型的分子證據(jù)。 本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的技術(shù)路線為：在體外使用經(jīng)典的M1誘導(dǎo)劑IFN-γ/LPS和M2誘導(dǎo)劑IL-4誘導(dǎo)處于M0狀態(tài)的小鼠巨噬細(xì)胞瘤系RAW264.7，建立以RAW264.7為試驗(yàn)用細(xì)胞的巨噬細(xì)胞極化屬性識(shí)別系統(tǒng)，為了鑒定系統(tǒng)建立是否成功，分別對(duì)已報(bào)道的多個(gè)Mφ極化表型指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)；為了考察日本血吸蟲(chóng)生活史不同發(fā)育階段來(lái)源抗原誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞的極化情況，在體外，使用不同的日本血吸蟲(chóng)抗原（正常尾蚴抗原NCA,輻照尾蚴抗原ACA,可溶性成蟲(chóng)抗原SWAP,可溶性蟲(chóng)卵抗原SEA）刺激RAW264.7，在體內(nèi)，獲得日本血吸蟲(chóng)自然感染不同階段來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞(感染前0w，感染后3w，6w，9w)，分別從精氨酸代謝途徑，表面標(biāo)志和細(xì)胞因子分泌三個(gè)方面對(duì)巨噬細(xì)胞極化類型進(jìn)行了鑒定；為了證明不同極化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞參與了血吸蟲(chóng)感染的免疫調(diào)節(jié)，運(yùn)用ELISA方法分別從蛋白水平檢測(cè)不同來(lái)源日本血吸蟲(chóng)抗原作用下巨噬細(xì)胞效應(yīng)/抑制分子的表達(dá)；為了探明Mφ極化分型跟TLRs及相應(yīng)通路的聯(lián)系，采用抗體封閉實(shí)驗(yàn)考查TLR2和TLR4在巨噬細(xì)胞極化中的作用；此外，還運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1/M2極化狀態(tài)下，共刺激分子和共抑制分子的表達(dá)。主要研究結(jié)果如下： 1.在本實(shí)驗(yàn)室條件下，成功建立了有效的Mφ極化分型的識(shí)別系統(tǒng)。 M1誘導(dǎo)劑IFN-γ/LPS和M2誘導(dǎo)劑IL-4可誘導(dǎo)處于M0狀態(tài)的小鼠巨噬細(xì)胞瘤RAW264.7，分別極化為M1和M2。 2.日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段來(lái)源抗原可誘導(dǎo)Mφ向不同方向極化。日本血吸蟲(chóng)正常尾蚴抗原NCA和輻照尾蚴抗原ACA都可刺激RAW264.7細(xì)胞相對(duì)于未刺激組表達(dá)高水平的inos，CD16/32也呈現(xiàn)出高表達(dá)，IL-12產(chǎn)生顯著增加(p0.01)，但NCA和ACA間無(wú)差異；日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原SEA刺激RAW264.7細(xì)胞相對(duì)于未刺激組,IL-10產(chǎn)生顯著增加, CD206顯示了高表達(dá)，表達(dá)高水平的arg1。結(jié)果表明NCA和ACA可誘導(dǎo)Mφ向M1極化，SEA可誘導(dǎo)Mφ向M2極化，SWAP中因?yàn)槌煞謴?fù)雜（含有SEA）可同時(shí)誘導(dǎo)M1和M2增加。 3.日本血吸蟲(chóng)自然感染過(guò)程中存在Mφ極化漂移的現(xiàn)象。即隨著感染發(fā)展的進(jìn)程，M1細(xì)胞表面標(biāo)志的CD16/32表達(dá)在3周達(dá)到最高，從6周開(kāi)始逐漸降低；M2細(xì)胞的表面標(biāo)志CD206的表達(dá)從3周開(kāi)始逐漸升高，在第9周達(dá)到最高。但在3-9周，我們還觀察到腹腔巨噬細(xì)胞根據(jù)F4/80熒光強(qiáng)度不同分為兩群，因?yàn)槲覀兾茨苷业胶线m的技術(shù)手段分離這兩群巨噬細(xì)胞，并分別鑒定這兩群細(xì)胞的極化屬性，于是我們繼續(xù)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12、IL-10分泌和相關(guān)因子iNOS、Arg-1基因的表達(dá)來(lái)鑒定全部巨噬細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)極化屬性。結(jié)果表明，產(chǎn)卵前腹腔巨噬細(xì)胞IL-12的基礎(chǔ)分泌量最高，之后表達(dá)逐漸減少，而IL-10的基礎(chǔ)分泌量在6w后開(kāi)始顯著增加；inos的表達(dá)在3w達(dá)到最高，arg1在產(chǎn)卵后表達(dá)顯著升高。證明了產(chǎn)卵前巨噬細(xì)胞以M1方向極化為主，產(chǎn)卵后趨于M2方向。 4.巨噬細(xì)胞極化后通過(guò)分泌細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)日本血吸蟲(chóng)感染過(guò)程中的免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞分泌的正向效應(yīng)分子（TNF-α，IL-12）在產(chǎn)卵前占優(yōu)勢(shì)，而負(fù)向調(diào)節(jié)分子（IL-10，TGF-β）的分泌在產(chǎn)卵后占優(yōu)勢(shì)。 5. TLR4信號(hào)通路的存在會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞的極化產(chǎn)生影響。TLR2被拮抗后對(duì)CD16/32和CD206的表達(dá)，細(xì)胞因子IL-10和IL-12的分泌，iNOS和Arg-1的表達(dá)都沒(méi)有顯著性影響。而TLR4被拮抗后，NCA刺激Mφ后CD16/32和iNOS的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低（P0.01），提示TLR4信號(hào)通路的存在對(duì)巨噬細(xì)胞向M1的極化有顯著的影響。而SEA刺激的CD206，IL-10，Arg-1的表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)變化沒(méi)有顯著性，原因待深入探索，可能與拮抗劑的劑量依賴性有關(guān)。 6.共刺激分子CD40，CD86和共抑制分子PD-L1在不同發(fā)育階段來(lái)源的抗原刺激下表達(dá)均上調(diào)，故未發(fā)現(xiàn)正向和負(fù)向調(diào)節(jié)的共刺激分子可直接對(duì)應(yīng)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化屬性的證據(jù)。但NCA刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)的PD-L1顯著高于SEA和SWA，NCA刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD86也顯著高于SEA和SWAP，提示如果共刺激分子參與巨噬細(xì)胞的極化的話，并不單一地依賴正向或負(fù)向調(diào)節(jié)的共刺激分子的作用，而可能取決于我們尚未認(rèn)識(shí)的正向或負(fù)向信號(hào)間微妙的平衡調(diào)節(jié)。關(guān)于共刺激信號(hào)參與巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)機(jī)制，在本研究中還只是停留在對(duì)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果的直觀描述和推論上，，但卻給我們留下了豐富的想像空間。 綜上所述，本研究明確了抗原微環(huán)境的變化確實(shí)是巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵。不同日本血吸蟲(chóng)抗原可以刺激巨噬細(xì)胞向不同類型極化，從而參與對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染引起的機(jī)體免疫應(yīng)答變化的調(diào)控，如對(duì)細(xì)胞免疫方面由Th1向Th2方向的極化有所貢獻(xiàn)。這為未來(lái)從巨噬細(xì)胞極化屬性調(diào)節(jié)入手，尋找可供發(fā)展新型免疫抑制劑的蟲(chóng)源性成分提供先導(dǎo)性實(shí)驗(yàn)論據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1617436