本文選題：結核分枝桿菌　切入點：表面蛋白　出處：《吉林大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目前，結核病仍是致死率最高的疾病之一，全球幾乎1/3人口為潛在結核患者，該人群中10%有發(fā)展為活動性結核的可能。MTB致病機理復雜，疫苗研制及診斷研究已成為研究的熱點。篩選候選疫苗及檢測抗原，有助于深入了解其致病機制。表面蛋白（分泌蛋白、跨膜蛋白等)介導細菌與宿主的相互作用，與宿主最初接觸過程中能破壞宿主組織，引起一系列級聯(lián)反應，在MTB致病過程中起重要作用，并影響宿主免疫防御。MTB表面蛋白具有靶向免疫細胞并在其內部潛伏增殖能力，了解MTB表面蛋白和宿主細胞的相互作用有利于了解MTB的致病機制。 本文構建MTB H37Rv全基因組表面蛋白噬菌體展示文庫，直接完成了表面蛋白篩選、鑒別、表達純化及功能分析過程，MTB H37Rv全基因組噬菌體展示文庫庫容量為105，經(jīng)過表面蛋白篩選后共得到840個陽性克隆。隨機挑選其中200個克隆測序分析，共得到47個包含信號肽序列的表面蛋白，因此預知840個陽性克隆將有188個表面蛋白，與目前軟件預測MTB所含表面蛋白總數(shù)（179個）相近，顯示出該展示系統(tǒng)的高效性。 利用MTB表面蛋白噬菌體展示文庫進行差減篩選，得到6個能與結核患者血清特異性結合的表面蛋白（Ag85B, ESAT-6, MPT-64, LpqA, cpsA和PapA2)。這些抗原在MTB毒力菌株中具有高表達性，從而導致其對于結核患者血清和BCG免疫血清顯示出不同的反應性。在活動性結核和治療后痰培養(yǎng)轉陰性結核患者之間cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白的血清學反應敏感性分別從80.1%降到13.3%和從79.3%降到14.0%。揭示在抗結核治療后抗原特異性血清學反應的動態(tài)變化，為篩選感染早期和潛伏期重要抗原提供了有效方法。 利用生物信息軟件將篩選的6個MTB表面蛋白進行B細胞表位預測，并合成17個B細胞表位多肽，ELISA方法檢測17個表位多肽與結核患者血清以及BCG免疫血清免疫學反應。結果顯示8條多肽對結核患者血清顯示特異性反應。同時表位多肽A1、C3和P3對痰培養(yǎng)陽性血清反應敏感性明顯高于對治療后痰培養(yǎng)陰性血清。利用ELISPOT和流式細胞檢測方法來評價在活動性結核患者以及治療后痰培養(yǎng)轉陰性結核患者之間cpsA, PapA2和PaPA2噬菌體融合蛋白和表位多肽A1、C3、P3抗原特異性IFN-γ反應差別。結果顯示，接受治療后cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白和表位多肽C3和A1抗原特異性IFN-γ反應性明顯降低。驗證了從感染期到恢復期抗原特異性血清學和T細胞免疫反應動態(tài)變化過程。證明PapA2、CspA表面蛋白是結核感染期的毒力因子，為進一步篩選結核疫苗候選抗原提供理論基礎。 將cpsA, PapA2噬菌體融合蛋白聯(lián)合Ag85B+ESAT-6噬菌體融合蛋白構建多價疫苗，并對其免疫原性進行分析。應用多色流式細胞分析方法將不同免疫組的抗原特異性多功能T細胞亞群進行評價歸類，從而評價出抗結核免疫有效的宿T細胞亞群組成。結果顯示，新聯(lián)合蛋白組誘導高質量體液免疫和細胞免疫反應，明顯優(yōu)于單抗原免疫，，而表位多肽激發(fā)的免疫反應相對較弱。cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白聯(lián)合免疫組能激發(fā)Ag85B抗原特異性白細胞介素-2（IL-2）,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ-干擾素（IFN-γ）三種細胞因子、IL-2和TNF-α兩種細胞因子以及TNF-α單細胞因子的高表達，從而證明了cpsA和PapA2噬菌體融合蛋白可引起記憶性免疫應答。 本研究成功構建MTB表面蛋白噬菌體展示文庫，并利用該文庫進行差減篩選，從而篩選到6個能與結核患者血清特異性結合的表面蛋白，對篩選表面蛋白進行B細胞表位預測并合成相應表位多肽。利用ELISA和流式細胞檢測方法來評價在活動性結核患者以及治療后痰培養(yǎng)轉陰性結核患者之間噬菌體融合蛋白和表位多肽抗原特異性血清學反應及IFN-γ反應差別，揭示抗結核治療后抗原特異性血清學及IFN-γ反應性變化趨勢，為篩選結核感染期相關毒力因子提供平臺，亦為篩選疫苗候選基因提供理論基礎。同時將cpsA, PapA2噬菌體融合蛋白聯(lián)合Ag85B+ESAT-6噬菌體融合蛋白構建多價疫苗，從體液免疫反應水平、細胞因子表達水平、多功能細胞因子表達數(shù)量、T細胞亞群比例等多個指標對各組合疫苗所誘導免疫反應進行綜合評價，亦對抗結核免疫有效的宿主T細胞亞群組成進行系統(tǒng)詮釋，為結核疫苗提供新的評測標準。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 支軼,吳玉章,萬瑛;生物信息學方法在CTL表位預測中的應用[J];免疫學雜志;2005年02期

2 李曉恒;吳少庭;付小強;甘燕;王芳;雷蕾;;結核分枝桿菌Ag85B的基因克隆及表達[J];中國病原生物學雜志;2009年02期

本文編號：1609841