本文選題：黃曲霉毒素B1　切入點：獨特型抗體　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)是由寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和產(chǎn)毒黃曲霉(A. flavus)代謝產(chǎn)生,是目前已分離的十幾種黃曲霉毒素中最重要和毒性最大的毒素。AFB1主要污染大米、玉米、花生、花生油和動物肝臟、干咸魚以及核桃、椰奶等農(nóng)副產(chǎn)品。世界上幾乎所有的國家和地區(qū)都規(guī)定了食品及飼料中AFB1的最大允許含量并將其作為強制性標準進行檢測和控制。目前常用的檢測AFB1的方法主要有薄層色譜法(thin layer chromatography, TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)、以酶聯(lián)免疫為基礎(chǔ)的免疫分析以及生物傳感器法等。這些方法雖各有優(yōu)缺點,但都需要使用高濃度的AFB1標準品,檢測人員對于頻繁接觸AFB1這種強致癌物質(zhì)有很強的戒備心理；同時,AFB1標準品需要從國外進口,價格高昂,導致檢測成本偏高。 而一種新型的免疫試劑——抗獨特型抗體(anti-idiotype antibody, Aid),由于其在空間構(gòu)象上與AFB1毒素抗原存在著所謂的內(nèi)影像(internal image)關(guān)系,所以有望作為AFB1替代品用于AFB1的免疫學檢測,從而實現(xiàn)AFB1的無毒檢測,降低檢測成本。 本實驗目的在于通過制備AFB1抗獨特型抗體來替代免疫學檢測中的毒素標準品,從而建立無毒ELISA檢測體系。實驗首先采用胃蛋白酶酶切法對兔抗黃曲霉毒素抗體酶切,采用糖蛋白A柱分離純化制得F(ab')2,并采用SDS-PAGE.瓊脂糖雙向擴散法對其進行了分析鑒定。隨后,分別采用片段和完整抗體分子免疫了BALB/c小鼠,研究了不同免疫原產(chǎn)生的抗血清的差異,并采用ELISA對抗獨特型抗體與毒素AFB1間的替代關(guān)系進行了研究,具體內(nèi)容如下。 1.抗AFB1兔抗體的純化及其酶切條件的優(yōu)化 本研究首先以AFB1-BSA免疫日本大耳白兔得到的兔多克隆抗體為材料,采用飽和(NH4)2804鹽析法對抗體進行純化,采用SDS-PAGE和ELISA對純化抗體進行了鑒定。以此為材料,采用胃蛋白酶酶切制備F(ab')2片段,并以蛋白A親和層析法進行分離純化,以SDS-PAGE、雙向擴散法對F(ab')2片段的特性進行了分析。 以50%-33%-33%飽和(NH4)2804三步鹽析法純化抗體,回收率為25.7%。純化后,在體積不變的基礎(chǔ)上,抗體效價值從最初的7.88×105降為2.56×105,在原來基礎(chǔ)上降低3倍,靈敏度都在20ng/mL左右,基本無變化。電泳結(jié)果顯示,經(jīng)純化,大量雜蛋白被除去,得到的蛋白質(zhì)大多數(shù)為IgG,基本達到電泳純。 采用胃蛋白酶酶切IgG,通過對酶解條件的分析,得到最優(yōu)水解條件為：0.4 mol/L NaAc, pH 4.0,酶與抗體比例為1：10(w/w),37℃水浴鍋內(nèi)反應4h；酶切前酸化前后抗體的比效價稍微有些下降,但變化不大。 2.抗獨特型抗體的制備及其性質(zhì)研究 以上述純化得到的抗AFB1抗體(anti-AFB1 antibody, Ab1)及其酶解片段F(ab')2為抗原,分別免疫BALB/c小鼠,制備它們的抗獨特型抗體(anti-idotype antibody, Ab2)。以Ab1為免疫原時,免疫劑量為50 gg/次/只,共3只(1-3號)小鼠,免疫周期為14d；以F(ab')2為免疫原時,免疫劑量為100μg/次/只,共3只(4-6號)小鼠,免疫周期為14d。抗體產(chǎn)生進程分析結(jié)果表明,小鼠均對Ab1和F(ab')2產(chǎn)生了很好的免疫應答,制備得到了相應的Ab2。在此基礎(chǔ)上,對Ab2的性質(zhì)進行了分析,結(jié)果如下。 采用pH分別為6.0、7.4、8.0的PBS (phosphate buffered saline),以及pH為9.6的CBS (carbonate buffer solution)等不同pH緩沖液對Abl的包被條件進行了研究。結(jié)果表明,pH 8.0的PBS緩沖液為最優(yōu)包被液。以該pH值的緩沖液包被Abl,對2號小鼠Ab2血清做方陣滴定試驗,確定Abl最佳包被濃度為0.25μg/mL。采用上述包被條件,對各小鼠Ab2抗血清的ELISA效價進行了分析。結(jié)果表明,1、2、3號小鼠的Ab2的ELISA效價分別為1：1.02×106、1：1.02×106、1：2.05×106；4、5、6號小鼠的效價為1：3.2×104、1：6.4×104、1：1.6×104。由此可以看出,以完整分子免疫的抗體Abl為抗原的效價要明顯高于其片段F(ab')2的效價。初步推斷,抗體的Fc片段可以增強小鼠的免疫應答。 進一步以1μg/mL AFB1-cOVA為包被抗原,以Ab1為抗體,采用間接競爭ELISA對Ab2的性質(zhì)進行了分析。結(jié)果表明,以AFB1標品對Ab1做標準曲線時,靈敏度為6.82 ng/mL;以2號小鼠的Ab2對Ab1做標準曲線時,靈敏度為85.51μg/mL,相當于6.82 ng/mLAFB1,檢測限為0.65μg/mL,線性范圍為0.01-200μg/mL；以4號小鼠的Ab2對Ab1做標準曲線時,靈敏度為28.24μg/mL;相當于6.82ng/mLAFB1,檢測限為0.01μg/mL,線性范圍為0.01～100μg/mL。內(nèi)影像實驗表明,以4號小鼠的血清與AFB1的結(jié)構(gòu)類似性優(yōu)于2號小鼠,故以F(ab')2片段為免疫抗原得到的Ab2質(zhì)量優(yōu)于以Ab1為抗原的Ab2,與文獻報道的相同。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：1593133