本文選題：剛地弓形蟲　切入點(diǎn)：生物信息學(xué)分析　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實(shí)驗?zāi)康?對剛地弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2(TgPGAM2)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并對該基因進(jìn)行克隆、表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物純化后分析其免疫原性;觀察重組弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2蛋白(rTgPGAM2)免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及其抗弓形蟲感染的能力,探討TgPGAM2作為弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。 實(shí)驗方法 第一部分:綜述脊椎動物、無脊椎動物、原生動物等不同來源PGAM蛋白的理化性質(zhì)及研究進(jìn)展。 第二部分:對TgPGAM2基因的主要特性及抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMHMM、HNN、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息學(xué)在線分析程序,結(jié)合Gene Runner、DNAman等生物信息學(xué)軟件,分析、預(yù)測TgPGAM2蛋白的理化性質(zhì)、可溶性、表面可及性可塑性,跨膜區(qū),翻譯后修飾位點(diǎn)、親(疏)水性、二級結(jié)構(gòu)、抗原表位等。 第三部分:構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPGAM2,并在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性蛋白。對原核表達(dá)的rTgPGAM2進(jìn)行純化及免疫原性分析。收集、純化RH株弓形蟲速殖子,提取總RNA;設(shè)計合成引物并引入Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn),RT-PCR擴(kuò)增編碼TgPGAM2的基因片段克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a中,陽性克隆經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定陽性克隆;在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。大量表達(dá)rTgPGAM2,以Ni-NTA層析法純化蛋白,用兔抗弓形蟲血清做Western blotting分析其免疫原性。 第四部分:觀察不同劑量rTgPGAM2滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答及抗弓形蟲感染作用。BALB/c小鼠60只隨機(jī)分為5組,免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μg rTgPGAM2/只滴鼻免疫小鼠,免疫2次,間隔2周,rTgPGAM2溶于20μl PBS中,對照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d,隨機(jī)取每組5只小鼠,頸椎脫臼處死,檢測腸液sIgA和血清IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ,分離并計數(shù)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IEL)及脾淋巴細(xì)胞。其余35只小鼠每只用1×104個速殖子灌胃,觀察小鼠健康情況。攻擊后第30d,頸椎脫臼處死小鼠,計數(shù)肝、腦組織內(nèi)弓形蟲速殖子。 實(shí)驗結(jié)果 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),剛地弓形蟲PGAM2有10個表面可及性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、3個親水性參數(shù)得分≥1.9的區(qū)域、3個柔韌性參數(shù)得分≥2的區(qū)域、8個翻譯后修飾位點(diǎn)、16個潛在抗原表位,可能具有免疫原性。 以RH株弓形蟲速殖子的cDNA為摸板,擴(kuò)增獲得756bp的TgPGAM2基因片段,并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPGAM2;IPTG誘導(dǎo)后行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá),相對分子量(Mr)約30ku。Western blotting顯示,純化后的rTgPGAM2能被兔抗弓形蟲免疫血清識別。 30μg組血清IgG(A495=0.9704)、IFN-γ(A405=0.8456),腸液IgA(A495=0.9098)高于20μg組(血清IgG、IFN-γ,腸液IgA A495分別為0.8213、0.7244、0.6504),組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.741, F=4.53, F=6.94,P0.05)。血清IL-2和IL-4組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。攻蟲后第7～14d,各組小鼠均出現(xiàn)倦怠、活動減少、飲水及采食減少等表現(xiàn),對照組小鼠死亡2只;40μg組1只。30μg組肝(58.3×10~5/g)、腦(3.99×10~5/g)組織內(nèi)速殖子蟲荷顯著低于對照組(肝93.88×10~5/g、腦5.65×10~5/g)和10μg組(肝85.54×10~5/g、腦4.86×10~5/g),組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.56,F=9.31,F=7.39,F=9.68,P0.05)。 結(jié)論 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),剛地弓形蟲PGAM2存在16個潛在的抗原表位,可能具有免疫原性。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPGAM2并在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性蛋白。原核系統(tǒng)表達(dá)的rTgPGAM2具有免疫原性。30μg組rTgPGAM2滴鼻免疫更有效誘導(dǎo)了黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答,并有效降低弓形蟲感染鼠肝、腦組織中的蟲荷。本研究的結(jié)果表明,剛地弓形蟲PGAM2具有免疫原性,并能誘導(dǎo)有效的黏膜和免疫應(yīng)答,有可能作為弓形蟲疫苗的候選抗原。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R38

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：1576194