本文關(guān)鍵詞： 脊髓灰質(zhì)炎病毒 感染性克隆 拯救病毒 核定位信號　出處：《吉林大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（Severe acute respiratory syndrome，SARS)是2003年出現(xiàn)的新發(fā)傳染病，其病情重，死亡率高，，嚴(yán)重危害人類健康。雖然SARS的病原已確定為SARS相關(guān)冠狀病毒（SARS-CoV），國內(nèi)外研究也檢測了SARS患者標(biāo)本中的腺病毒、呼吸道合胞病毒、亨德拉病毒（hendra virus）、尼帕病毒（nipah virus）、流感病毒、人偏肺病毒等其他病原體，但是未曾檢測過脊髓灰質(zhì)炎病毒。我們在研究SARS的過程中發(fā)現(xiàn)SARS患者標(biāo)本中可能有腸道病毒屬的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株SabinⅠ存在，為確證這個(gè)結(jié)果，本研究采用世界衛(wèi)生組織推薦的分離脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法和人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系（human rhabdomyosarcoma，RD），對取自SARS患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒分離并成功獲得病毒，通過中和試驗(yàn)和間接免疫熒光染色證實(shí)屬于脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）等分子生物學(xué)技術(shù)分段擴(kuò)增病毒基因組并測序，從基因水平進(jìn)一步證實(shí)其為脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ型疫苗類似株。在確定從SARS患者標(biāo)本中分離獲得脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ型疫苗類似株后，需要從流行病學(xué)角度進(jìn)一步分析其是否在更多患者中存在，因此本研究根據(jù)獲得的病毒基因組序列設(shè)計(jì)針對5′-UTR、VP3 VP1和2C-3A區(qū)3個(gè)部位的引物分別擴(kuò)增SARS患者標(biāo)本中提取的RNA，結(jié)果顯示38.5%(5/13)的唾液標(biāo)本、37.5%(3/8)的痰標(biāo)本、71.4%(5/7)的尿液標(biāo)本、100%(5/5)的咽拭子標(biāo)本和100%(6/6)的糞便標(biāo)本中可以擴(kuò)增出脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ核酸，證實(shí)71.4% (15/21)的SARS患者體內(nèi)存在脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ型且480和2795位點(diǎn)出現(xiàn)回復(fù)突變，其中擴(kuò)增陽性患者的死亡率高于擴(kuò)增陰性患者；研究結(jié)果同時(shí)顯示SARS患者的腸道和腎組織中可以檢測到脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ存在。為防止實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，研究中設(shè)置了嚴(yán)格的對照并重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果，其中對照樣本的擴(kuò)增結(jié)果顯示取自25個(gè)健康人和25例肝炎患者的50份糞便標(biāo)本僅1份陽性（2%），與患者組相比，其差異具有顯著性意義（p㩳0.01）。雖然在患者中沒有發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎相關(guān)癥狀體征，排除了疫苗相關(guān)麻痹型脊髓灰質(zhì)炎的可能，但是由于研究組患者均為成年人，其體內(nèi)脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ的存在提示在脊髓灰質(zhì)炎的流行病學(xué)監(jiān)測體系中，除了15歲以下的兒童，還需要加強(qiáng)對成人特別是嚴(yán)重呼吸道感染和免疫功能受損人群的病毒學(xué)檢測和抗體檢測，對血清脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體滴度顯著下降的人群應(yīng)該及時(shí)加強(qiáng)免疫。盡管標(biāo)本檢測得到了陽性結(jié)果，但是由于未能系統(tǒng)收集并檢測各種標(biāo)本，導(dǎo)致結(jié)果分析受到限制，對脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ型疫苗類似株在SARS的發(fā)生發(fā)展中是否起作用以及有何種作用尚不能確定。 SARS患者體內(nèi)脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型疫苗類似株的首次發(fā)現(xiàn)表明需要加強(qiáng)脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株尤其是SabinⅠ的實(shí)驗(yàn)研究，由于目前廣泛應(yīng)用口服減毒活疫苗，且不斷出現(xiàn)疫苗相關(guān)麻痹型脊髓灰質(zhì)炎，如何降低SabinⅠ基因組的回復(fù)突變率以減少疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒的產(chǎn)生是當(dāng)務(wù)之急。如果能通過改造病毒的基因組使其在不降低免疫效果和安全性的前提下減少回復(fù)突變率，將有助于降低疫苗相關(guān)麻痹型脊髓灰質(zhì)炎的發(fā)病率，而研究病毒基因組的功能首先需要構(gòu)建感染性cDNA克隆拯救病毒。為此，在一次性擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ基因組全長7441個(gè)核苷酸難度較大的情況下，本研究利用SabinⅠ基因組序列中2470位的限制性內(nèi)切酶NheⅠ識別位點(diǎn)和5601位的限制性內(nèi)切酶BglⅡ識別位點(diǎn)，通過分別擴(kuò)增基因組1nt-2497nt、2412nt-5616nt和5588nt-7441nt核苷酸序列并插入克隆載體，然后分步酶切連接的方法成功獲得脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ感染性cDNA克隆。在感染性克隆構(gòu)建成功后開展了SabinⅠ病毒拯救研究，本文在轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA的步驟中，沒有選擇常用但是昂貴、費(fèi)力的體外轉(zhuǎn)錄，而是首次在脊髓灰質(zhì)炎病毒拯救中利用近年來開始出現(xiàn)的真核表達(dá)載體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)T7RNA聚合酶后轉(zhuǎn)錄RNA的技術(shù)，結(jié)果成功拯救SabinⅠ，從而為進(jìn)一步研究脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ的基因功能奠定了基礎(chǔ)。核定位信號有助于將蛋白質(zhì)從細(xì)胞胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，以往有關(guān)包括脊髓灰質(zhì)炎病毒在內(nèi)的腸道病毒拯救的研究中，體內(nèi)拯救時(shí)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的T7RNA聚合酶都沒有涉及核定位信號，為了解核定位信號對病毒拯救效果的影響，本研究在拯救病毒時(shí)分別構(gòu)建了含與不含SV40大T抗原核定位信號PKKKRKV的T7RNA聚合酶真核表達(dá)質(zhì)粒，然后將其分別與脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ感染性cDNA克隆共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然表達(dá)含或不含核定位信號的T7RNA聚合酶都能夠拯救病毒，但是表達(dá)含核定位信號的T7RNA聚合酶拯救病毒的效果要優(yōu)于不含核定位信號的T7RNA聚合酶，提示脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ感染性cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢部位可能在細(xì)胞核內(nèi)，推測其與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子等轉(zhuǎn)錄相關(guān)分子較多有關(guān)，這是在腸道病毒拯救機(jī)制研究中的首次發(fā)現(xiàn)。由于脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ型的自然復(fù)制主要在胞漿內(nèi)，研究結(jié)果顯示病毒自然復(fù)制與病毒拯救的差異，從而有助于脊髓灰質(zhì)炎病毒細(xì)胞內(nèi)拯救機(jī)制的研究。 為尋找降低脊髓灰質(zhì)炎病毒SabinⅠ回復(fù)突變率的方法，本研究采用單引物二次PCR的方法將SabinⅠ感染性cDNA克隆3D聚合酶第64位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸并成功獲得拯救病毒，初步結(jié)果顯示突變后SabinⅠ感染性克隆的病毒拯救效率下降，為下一步研究突變后拯救病毒的生長特性、毒力和回復(fù)突變率奠定了基礎(chǔ)。 總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)成人SARS患者體內(nèi)存在脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株SabinⅠ，并發(fā)現(xiàn)在T7RNA聚合酶中插入核定位信號有助于脊髓灰質(zhì)炎病毒的拯救，這些結(jié)果有助于脊髓灰質(zhì)炎流行病學(xué)和脊髓灰質(zhì)炎病毒拯救機(jī)制的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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