本文關鍵詞： 電化學傳感器 金納米顆粒 發(fā)夾型探針 DNA甲基化酶 抑制劑　出處：《湖南大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：DNA甲基化是表觀遺傳中最主要的作用方式，其在基因表達調控、基因組印跡、胚胎發(fā)育、維持正常細胞功能等過程中起著極其重要的作用。人類許多重大疾病如癌癥、遺傳性疾病都與DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相關。因此，研究DNA甲基化過程和分析DNA甲基化酶活性，受到了研究者們的廣泛關注。由于傳統(tǒng)的檢測方法存在耗時、不連續(xù)、大多需要放射性標記等缺點，于是發(fā)展新的簡便、經濟、靈敏的甲基化監(jiān)測手段和甲基化酶檢測方法便已成為生化分析和臨床診斷等領域愈加迫切的需求。電化學生物傳感器具有靈敏度高、操作簡便、響應快速、易于微型化、測試費用低等優(yōu)點，在各種目標物的檢測中得到了廣泛的研究和應用，也為DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究提供了新的契機。本論文以甲基化酶活性的高靈敏檢測為目標，基于核酸分子探針及納米材料信號放大作用構建了不同的電化學生物傳感器，主要包括以下三方面的研究工作： 一、基于金納米顆粒信號放大作用的DNA甲基化酶免標記電化學檢測 利用DNA功能化金納米顆粒的信號放大作用，發(fā)展了一種便捷、高靈敏電化學檢測Dam甲基化酶活性的新方法。首先在金電極上修飾單鏈DNA，當不存在Dam甲基化酶時，互補DNA修飾的金納米顆粒通過雜交作用，靠近電極表面，此時是“eT OFF”狀態(tài)；當檢測體系中有Dam甲基化酶和Dpn I限制性內切酶時，DNA雙鏈被甲基化并切斷，使得金納米顆粒遠離電極表面，電子可以自由傳遞，產生可檢測的電化學信號（eT ON）。金納米顆粒自身的空間位阻作用會阻礙電極表面的電子傳遞，同時，金納米顆粒上修飾有大量帶負電荷的DNA，由于靜電斥力，進一步阻礙帶負電荷的電活性物質鐵氰化鉀與電極表面的電子傳遞，從而實現信號的放大。該方法實現了對Dam甲基化酶的特異性檢測，檢測限為0.12U/mL，并且能用于對甲基化酶敏感藥物的篩選。 二、基于甲基化響應的發(fā)夾型捕獲探針電化學檢測DNA甲基化酶活性 結合亞甲基藍標記的報告探針和甲基化響應的發(fā)夾型捕獲探針，構建了一種靈敏的電化學生物傳感器用于檢測甲基化酶活性。在該方法中，發(fā)夾型捕獲探針的莖部包含甲基化酶識別位點。當甲基化酶不存在時，發(fā)夾型結構保持完整，捕獲探針封閉在其莖部結構中，這阻礙了報告探針與捕獲探針之間的雜交，使得標記在報告探針上的電活性物質亞甲基藍不能靠近電極表面，處于“eT OFF”狀態(tài)。而當甲基化酶存在時，該位點被甲基化，進而被限制性內切酶切割，使得與報告探針互補的捕獲鏈暴露出來，通過DNA鏈之間的互補配對，報告探針上標記的亞甲基藍靠近電極，從而發(fā)生電子傳遞，產生可測量的電化學信號。以Dam甲基化酶為例，該方法檢測限為0.07U/mL，并且可以實現對甲基化酶的動力學研究及相關抑制劑篩選。 三、基于發(fā)夾型探針和G-四聚體結構免標記電化學檢測DNA甲基化酶 將電活性物質Hemin可以特異性的與富G序列結合形成具有穩(wěn)定結構的G-四聚體這一特性，應用于甲基化酶活性的電化學檢測。設計了甲基化響應的發(fā)夾型探針，其莖部包含甲基化酶的識別位點及一段特異性的富G序列，當甲基化酶不存在時，該序列被封鎖在發(fā)夾型探針的莖部，不能與Hemin結合，從而沒有電化學信號的產生，此時是“eT OFF”的狀態(tài)；當甲基化酶和限制性內切酶存在時，發(fā)夾型探針莖部甲基化酶的識別位點被甲基化并被切割，暴露出能與Hemin結合的富G序列，使得Hemin靠近電極表面，產生可測量的電化學信號。該方法實現了對Dam甲基化酶快速，便捷，高靈敏的電化學檢測，檢測下限為0.2U/mL。
[Abstract]:DNA methylation plays a very important role in the process of gene expression regulation , genome imprinting , embryo development and normal cell function . 1 . DNA methylase - free electrochemical detection based on gold nanoparticle signal amplification A novel method for detecting Dam methylase activity by using DNA functionalized gold nanoparticles is developed . Firstly , single - stranded DNA is modified on the gold electrode . When there is no Dam methylase , the complementary DNA - modified gold nanoparticles are hybridized to the surface of the electrode , which is the " eT OFF " state . When the detection system has Dam methylase and DpnI restriction enzyme , the DNA double - stranded DNA is methylated and cut off so that the gold nanoparticles are away from the surface of the electrode , electrons can be freely transferred , and the detectable electrochemical signal ( eT ON ) can be generated . A large amount of negatively charged DNA is modified on the gold nanoparticles . Due to the electrostatic repulsive force , the electron transfer between the potassium cyanide and the electrode surface of the negatively charged electroactive material is further hindered , thereby realizing amplification of the signal . 2 . Detection of DNA methylase activity electrochemically by hairpin - type capture probe based on methylation response A sensitive electrochemical biosensor for detecting methylase activity is constructed in combination with methylene blue - labeled reporter probes and methylation - responsive hairpin - type capture probes . In this method , the hairpin - type capture probes contain methylase recognition sites . III . DNA methylase - free electrochemical detection based on hairpin - type probes and G - tetrameric structures A hairpin - type probe with stable structure is formed by binding an electroactive substance Hemin with a rich G sequence to form a G - tetramers with stable structure . The hairpin - type probe is designed with methylation response , and the stem part of the hairpin - type probe is blocked on the stem part of the hairpin type probe when the methylase does not exist ;

【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R341

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉長春,崔大付;電化學傳感器及其在芯片實驗室中的應用[J];傳感器技術;2003年07期

2 伍林,曹淑超,易德蓮,劉娟,秦曉蓉,歐陽兆輝;酶生物傳感器的研究進展[J];傳感器技術;2005年07期

3 馬莉萍;毛斌;劉斌;李工農;韓根亮;劉國漢;;生物傳感器的應用現狀與發(fā)展趨勢[J];傳感器與微系統(tǒng);2009年04期

4 池其金,董紹俊;酶直接電化學與第三代生物傳感器[J];分析化學;1994年10期

5 毛秀玲;吳堅;應義斌;;電化學生物傳感器在發(fā)酵領域中的應用[J];分析化學;2008年12期

6 范瑾瑾;電化學免疫傳感器測定Ag-Ab反應[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;1995年04期

7 白堅石,何忠效,張昱;DNA甲基化作用對HL-60細胞中蛋白質-核酸相互作用的影響[J];中國科學C輯:生命科學;2000年01期

8 吳烈善,王瑛輝,薛柳;納米材料及其應用前景[J];礦產與地質;2001年06期

9 袁若;;電化學蛋白質生物傳感器的研究[J];化學傳感器;2011年04期

10 溫志立;免疫傳感器的發(fā)展概述[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2001年04期

相關博士學位論文 前1條

1 鄭靜;基于納米金膠和磁性納米顆粒的DNA和凝血酶蛋白質電化學檢測的研究[D];華東師范大學;2007年

，

本文編號：1533085