本文關(guān)鍵詞： AOPPs 噬細(xì)胞 ABCA1 表達(dá) 膽固醇 流出 影響 機(jī)制　出處：《南華大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As）性心血管疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其發(fā)生機(jī)制涉及脂質(zhì)代謝異常、炎癥、氧化應(yīng)激等眾多因素。單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，吞噬脂蛋白源性的膽固醇，從而在血管壁上形成泡沫細(xì)胞，這是動脈粥樣硬化發(fā)病過程中一個最主要的事件。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是一種整合膜蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝過程中起著十分重要的作用。ABCA1以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂流出，結(jié)合到細(xì)胞表面的載脂蛋白A-I（apoA-I），從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)。研究表明，ABCA1不僅在HDL合成和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用，而且是抑制動脈粥樣硬性心血管疾病的一個潛在靶標(biāo)。 晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPPs），主要是由血漿蛋白被次氯酸修飾而形成，是一種新的氧化損傷標(biāo)志物。臨床和基礎(chǔ)研究均提示AOPPs可能在促動脈粥樣硬化發(fā)展方面起著十分重要的作用，并有研究者提出AOPPs是動脈粥樣硬化性心血管疾病的獨(dú)立危險因素，但是AOPPs致動脈粥樣硬化的分子機(jī)制尚不清楚。有研究認(rèn)為AOPPs可增加動物模型體內(nèi)動脈粥樣硬化病變，增加斑塊處氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的沉積、巨噬細(xì)胞浸潤和平滑肌細(xì)胞增殖，提示AOPPs不僅只是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，可能與脂質(zhì)代謝相關(guān)。 Janus激酶(JAK)和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)途徑是一種重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。JAK/STAT信號途徑是一種應(yīng)激反應(yīng)信號級聯(lián)放大的信號途徑，它可以介導(dǎo)信號從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。許多血管應(yīng)激因子都可以通過JAK/STAT信號途徑的活化而產(chǎn)生血管疾病，并且JAK/STAT信號途徑也是動脈粥樣硬化性血管損害的關(guān)鍵調(diào)控途徑。有研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT1信號途徑與肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）、ABCA1表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出密切相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)JAK/STAT1信號途徑是干擾素γ（IFN-γ）下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑，阻斷JAK/STAT1信號途徑明顯上調(diào)ABCA1的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。 本研究從調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子——ABCA1入手，并通過不同方法干預(yù)JAK/STAT1信號途徑，觀察其對AOPPs作用的影響，以探討AOPPs與ABCA1之間的作用關(guān)系及信號傳導(dǎo)機(jī)制，從而為揭示AOPPs在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用和機(jī)制提供新的研究思路。 第一部分AOPPs對THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的影響 目的：觀察AOPPs對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響，同時觀察膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵分子——ABCA1表達(dá)的變化。 方法：培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株，以佛波酯(PMA)和oxLDL誘導(dǎo)分化并形成泡沫細(xì)胞，復(fù)制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。以AOPPs處理細(xì)胞，觀察AOPPs對膽固醇流出及ABCA1表達(dá)影響的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)。以液體閃爍計數(shù)法、油紅O染色及高效液相色譜法分別檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出、脂滴及膽固醇含量。采用實(shí)時定量PCR、Western blotting免疫印跡分別檢測細(xì)胞中ABCA1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果：不同濃度的AOPPs（0，50，100，200μmol/L）處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞后，液體閃爍計數(shù)法檢測顯示，細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出減少。高效液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯增加，而油紅O也顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增加，并且AOPPs的作用呈濃度依賴性。對ABCA1表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，AOPPs可使細(xì)胞ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，作用效應(yīng)也呈濃度依賴性。以100μmol/LAOPPs分別處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時間（0，12，24，48小時），經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出減少，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯增加，細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增加，且隨時間的延長，效應(yīng)越明顯，提示AOPPs的作用呈時間依賴性。實(shí)時定量PCR、Western blotting免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中ABCA1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)也呈時間依賴性下調(diào)。 結(jié)論：①AOPPs呈時間和濃度依賴性抑制THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積；②AOPPs呈時間和濃度依賴性抑制THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1的表達(dá)。 第二部分AOPPs抑制THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)的機(jī)制 目的：探討AOPPs抑制THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1的表達(dá)和減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的可能分子機(jī)制。 方法：培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株，以佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和ox-LDL誘導(dǎo)分化并形成泡沫細(xì)胞，復(fù)制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。采用AOPPs和（或）LXRα、JAK/STAT1信號途徑中關(guān)鍵分子的相關(guān)激動劑、抑制劑、RNA干擾等因素共同處理細(xì)胞，以液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出率，采用實(shí)時定量PCR、Western blotting免疫印跡分別檢測細(xì)胞中ABCA1、LXRα mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并檢測STAT1和JAK2磷酸化蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：分別采用AOPPs和（或）LXRα激動劑22(R)-Hch、LXRα siRNA處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對照組比較，22(R)-Hch能明顯上調(diào)細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，而采用LXRα siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，LXRα siRNA下調(diào)細(xì)胞ABCA1、LXRα的表達(dá)；與單獨(dú)用AOPPs處理組細(xì)胞比較，AOPPs與22(R)-Hch共處理組細(xì)胞ABCA1的表達(dá)上調(diào)，而AOPPs與LXRα siRNA共處理組細(xì)胞ABCA1、LXRα的表達(dá)則下調(diào)。液體閃爍計數(shù)法檢測顯示，與單獨(dú)用AOPPs處理組細(xì)胞膽固醇流出率比較，AOPPs與22(R)-Hch共處理細(xì)胞的膽固醇流出率增加，，而AOPPs與LXRα siRNA共處理組細(xì)胞膽固醇流出率減少。經(jīng)Western blotting免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，AOPPs處理細(xì)胞15分鐘后，STAT1的酪氨酸（tyrosine，Tyr701）磷酸化增加，60分鐘更為明顯。采用STAT1siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用AOPPs處理后，其ABCA1、LXRαmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)（與單獨(dú)用AOPPs處理的細(xì)胞比較）。液體閃爍計數(shù)法檢測顯示，與AOPPs單獨(dú)處理組比較，STAT1siRNA與AOPPs共同處理細(xì)胞的膽固醇流出率增加。JAK抑制劑AG-490與AOPPs共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞中ABCA1、LXRα mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)高于單獨(dú)用AOPPs處理組的細(xì)胞，而膽固醇的流出率也高于單獨(dú)用AOPPs處理組細(xì)胞。與單獨(dú)用AOPPs處理組細(xì)胞比較，NADPH氧化酶抑制劑DPI與AOPPs共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞JAK2磷酸化減少，而細(xì)胞ABCA1、LXRα mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)則上調(diào)，膽固醇的流出增加。 結(jié)論：①AOPPs通過調(diào)控LXRα的表達(dá)，從而抑制THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1的表達(dá)和膽固醇流出；②AOPPs經(jīng)JAK/STAT信號途徑調(diào)節(jié)ABCA1的表達(dá)及細(xì)胞膽固醇流出；③AOPPs經(jīng)NADPH氧化酶影響JAK/STAT信號途徑的活化。 第三部分AOPPs對apoE基因敲除小鼠As病變及ABCA1表達(dá)的影響 目的：以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠為研究對象進(jìn)行體內(nèi)研究，觀察AOPPs對apoE KO小鼠ABCA1表達(dá)、動脈粥樣硬化病變及脂質(zhì)蓄積的影響，初步探討其作用機(jī)制。 方法：8周齡雄性apoE-KO小鼠以高脂/高膽固醇（high-fat/high-cholesteroldiet，HF/HC，15%豬油+0.25%膽固醇）飼料飼養(yǎng)，小鼠隨機(jī)分為四組（每組10只）。其中，對照組僅飼以高脂/高膽固醇飲食，隔天腹腔注射與實(shí)驗(yàn)組同等劑量的生理鹽水；AOPPs組除飼以高脂/高膽固醇飲食外，隔天腹腔注射AOPPs（劑量5mg/kg）；AG-490組除飼以高脂/高膽固醇飲食外，隔天腹腔注射AG-490（劑量5mg/kg）；AOPPs+AG490組除飼以高脂/高膽固醇飲食外，隔天腹腔注射AOPPs和AG-490（劑量均為5mg/kg）。采用全自動生化分析儀進(jìn)行酶法測定血脂；HE染色和油紅O染色分別觀察主動脈竇處動脈粥樣硬化病變及脂質(zhì)蓄積情況，同時觀察肝臟結(jié)構(gòu)變化及脂質(zhì)蓄積情況；以實(shí)時定量PCR、Western blotting免疫印跡和免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠主動脈、肝及小腸組織的ABCA1、LXRα mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果：結(jié)果顯示，與對照組比較，AOPPs組小鼠血脂水平升高，主動脈竇處病變面積增大，油紅O染色顯示主動脈竇處病變組織脂滴增加較明顯；而與AOPPs組小鼠比較，AOPPs+AG490組小鼠的血脂水平降低，主動脈竇處病變減輕，油紅O染色顯示主動脈竇處病變組織的脂滴減少。同時，光鏡下可見各組小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)都有不同程度損害，結(jié)構(gòu)排列較紊亂，其中AOPPs組小鼠肝臟組織破壞較為嚴(yán)重，脂肪空泡也較明顯，油紅O染色顯示其肝臟組織中脂滴增加；而AOPPs+AG-490組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的破壞程度相對較輕，油紅O染色可見其肝臟脂滴減少（與AOPPs組小鼠比較）。此外，小鼠主動脈、肝、小腸組織的ABCA1和LXRα表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，AOPPs組小鼠ABCA1和LXRα的表達(dá)下調(diào)；而與AOPPs組比較，AOPPs+AG-490組小鼠ABCA1和LXRα的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：①AOPPs增加apoE-KO小鼠體內(nèi)脂質(zhì)蓄積，促進(jìn)其動脈粥樣硬化病變的發(fā)展；②AOPPs可以下調(diào)apoE-KO小鼠主動脈、肝臟、小腸和腹腔巨噬細(xì)胞ABCA1、LXRα的表達(dá)；③JAK抑制劑AG-490可抑制AOPPs對ABCA1表達(dá)的影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮淑芝;陳s

本文編號：1524294