本文關鍵詞： STAT1 p65 IFNγ 內毒素耐受 RAW264.7　出處：《山東大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分,可以有效的激活巨噬細胞。內毒素耐受(endotoxin tolerance, ET)是指動物或體外培養(yǎng)的單核／巨噬細胞等在給予小劑量的LPS預處理后,對LPS再次刺激時無反應或反應性明顯降低的現(xiàn)象。臨床上,敗血癥患者單核巨噬細胞出現(xiàn)耐受狀態(tài)會導致機體的免疫抑制甚至是死亡。通過對鼠的巨噬細胞及人的單核細胞的內毒素耐受研究發(fā)現(xiàn),先用小劑量LPS預處理后,再用正常劑量LPS處理細胞,許多的炎性因子和趨化因子(如TNF α,IL-6,IL-12,IL-1b,CCL3,CCL4和CXCL10)出現(xiàn)低表達現(xiàn)象,然而,許多的抗炎性細胞因子(如IL-10,TGF-β,IL-1),C型凝集素受體(如MARCO, CLEC4a和CD64)及負向調節(jié)因子(如IRAK-M)等分子則出現(xiàn)高表達現(xiàn)象。除了單核巨噬細胞外,樹突狀細胞與中性粒細胞等其它骨髓來源的細胞也受到內毒素耐受的影響。發(fā)生內毒素耐受的樹突狀細胞的細胞因子如IL-6,IL-12和TNF α的表達受到抑制,但是IL-10的表達和細胞內吐作用則產(chǎn)生明顯的增強。 大量文獻報道,內毒素耐受可以作為一種負反饋的免疫調節(jié)方式在許多生命活動中發(fā)揮重要作用；。；對內毒素耐受的調節(jié)是多水平方面的,包括：受體水平的調節(jié),信號分子通路水平的調節(jié),負向作用分子的調節(jié),轉錄后調節(jié)及染色質重塑水平的調節(jié),以及MicroRNA水平的調節(jié)。這些機制對于內毒素耐受的調節(jié)共同發(fā)揮著重要的作用。 長期以來,對于內毒素耐受機制的研究,已經(jīng)有很多報導,但是關于如何打破內毒素耐受形成及關于內毒素耐受消除機制的研究卻鮮有報導。因此在完善內毒素耐受理論方面及治療內毒素耐受引起的重大臨床疾病方面,研究內毒素耐受消除的機制都有著重大意義。 基于以上,本研究擬從以下幾個方面進行： 研究目的： 1、參照相關文獻建立了IFN γ介導的打破內毒素耐受形成的模型,檢測STAT1分子在IFN γ刺激中對炎性因子產(chǎn)生的影響； 2、研究STAT1分子在內毒素刺激及IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的現(xiàn)象中發(fā)揮什么樣的作用； 3、探討STAT1分子對IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中發(fā)揮作用的機制。 研究方法： 1、建立IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,并檢測STAT1分子對炎性因子產(chǎn)生的影響。 1.1IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中炎性因子的檢測 參照相關文獻建立了IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型。通過RT-PCR檢測不同炎性因子的mRNA水平變化及通過ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中的炎性因子的表達水平變化。 1.2RT-PCR分析IFNγ刺激不同細胞后細胞因子的變化 用RT-PCR的方法,檢測分析IFNγ刺激巨噬細胞系RAW264.7及小鼠腹腔來源的原代巨噬細胞中炎性因子的表達變化情況。 1.3檢測STAT1分子的小干擾RNA在IFNγ刺激細胞中的作用 首先在HEK293細胞及RAW264.7細胞系中用RT-PCR及Western Blot Blot方法驗證小干擾RNA的效率,然后將驗證好的小干擾RNA轉染細胞系并且用IFNγ刺激,檢測炎性因子表達的變化情況。 2、研究STAT1蛋白分子在打破內毒素耐受作用中與轉錄因子的相互作用。 2.1用IFNγ刺激巨噬細胞系RAW264.7后,檢測STAT1分子與轉錄因子的結合 我們用IFN γ(濃度為lOng/ml)刺激細胞系RAW264.7,分為對照組和刺激組,分別用P50、P65、P300的一抗做免疫共沉淀,然后進行Western Blot Blot實驗,用STAT1作為一抗,檢測STAT1分子在受到IFNγ刺激后,與不同轉錄因子的結合變化情況。 2.2研究在IFNγ介導的打破內毒素耐受的過程中,STAT1分子與轉錄因子的結合情況 參照相關文獻建立IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,對照組、耐受組和IFNγ預刺激組為一個研究組,分別用P50、P65、P300的一抗做免疫沉淀,然后然后進行Western Blot Blot實驗,用STAT1作為一抗,從而檢測STAT1分子與不同轉錄因子在耐受消除現(xiàn)象中的結合變化情況。 2.3轉染STAT1過表達載體和Myd88過表達載體以及NF-KB報告基因載體后,檢測NF-KB報告基因的活性變化 為了進一步證明我們關于STAT1結合P65之后起到的抑制NF-KB活性的猜想,我們設計了雙熒光報告基因實驗。在HEK293細胞中轉染了STAT1的表達質粒和接頭分子Myd88后,通過雙熒光報告基因的方法,檢測STATl分子對NF-к B報告質�；钚缘挠绊�。 3、在IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型中,分離質核蛋白檢測相關分子入核的變化。 基于以上實驗結果,我們得出STAT1分子可以與轉錄因子P65相互結合,從而干擾P65的活化,使下游的炎性因子如IL-6表達受到抑制,關于STAT1分子結合了P65之后是如何發(fā)揮抑制作用的機制,我們通過閱讀相關的文獻認識到STAT1分子作為一種轉錄因子的同時,還具有一種特殊的功能,就是STAT1可以與其它的轉錄因子相互結合后,作為一種cytoplasmic attenuator,通過抑制其它的轉錄因子活性來間接的對下游分子進行調節(jié)。因此,我們設計了質核蛋白分析的試驗。如下： 3.1在內毒素耐受中,分離提取細胞質核蛋白,檢測P50變化 建立IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,用LPS進行不同時間點的刺激后,分離提取細胞的質核蛋白質,然后進行Western Blot Blot實驗,用P50作為一抗,檢測P50分子的蛋白表達及分布情況。 3.2在內毒素耐受中,分離提取細胞質核蛋白,檢測P65變化 建立IFN γ介導的打破內毒素耐受形成的模型,用LPS進行不同時間點的刺激后,分離提取細胞的質核蛋白質,然后進行Western Blot Blot實驗,用P65作為一抗,檢測P65分子的蛋白表達及分布情況。。 研究結果： 1、成功建立了IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,同時發(fā)現(xiàn)STAT1分子影響了炎性因子IL-6的表達。 1.1建立了IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,明確了IL-6在模型中的表達變化情況 用細胞系RAW264.7設計了三組實驗,分別是對照組、耐受組和IFNγ預刺激組。先用低劑量的LPS刺激24h后,接著再用高劑量的LPS在不同時間點刺激,用RT-PCR方法檢測IL-6的mRNA水平的變化以及通過ELISA方法檢測了IL-6蛋白水平的變化,發(fā)現(xiàn)與耐受組相比,IFN γ預刺激組中,IL-6分子的表達水平出現(xiàn)明顯的恢復與上調,說明在IFNγ預刺激后,對耐受產(chǎn)生了明顯的消除作用,這都與已報道文獻中一致。 1.2用IFNγ刺激不同細胞系后,檢測到IL-6表達水平是明顯上調的 IFNγ在不同時間點刺激細胞系RAW264.7及小鼠腹腔來源的原代細胞,提取細胞RNA通過RT-PCR方法檢測,發(fā)現(xiàn)IL-6的mRNA水平隨著IFNγ刺激時間的增長出現(xiàn)明顯的上調。 1.3STAT1分子被干擾掉之后,再用IFNγ刺激細胞,檢測到IL-6表達水平出現(xiàn)下調 在HEK293細胞及RAW264.7細胞系中用RT-PCR及Western Blot方法驗證STAT1分子的小干擾RNA的效率,然后將干擾效率高的小干擾RNA轉染到RAW264.7細胞系中,再用IFNγ刺激不同時間點,用RT-PCR檢測到IL-6的mRNA水平與對照組相比,出現(xiàn)明顯下調的情況。這證明STAT1分子在炎性因子IL-6的表達中起到重要的調節(jié)作用。 2、通過免疫共沉淀方法,確定了STAT1分子與P65、P50、P300的結合。 2.1IFNγ刺激RAW264.7細胞系后,檢測到STAT1與P65、P50的結合增強 用IFNγ刺激RAW264.7細胞系,分為對照組和刺激組,提取細胞蛋白質,做蛋白質免疫共沉淀,Western Blot檢測到STAT1與P65,P50的結合在刺激組中比對照組中有明顯增強。 2.2在IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中,STAT1分子與P65、P50的結合在各組中不同 建立IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,分為對照組、耐受組和IFNγ預刺激組,LPS刺激不同時間點后,提取蛋白質,做蛋白質免疫共沉淀,WesternBlot檢測三組中STAT1與P65、P50的結合變化,發(fā)現(xiàn)IFN γ預刺激組與耐受組相比,STAT1分子與P65結合減弱,STAT1分子與P50結合增強。 2.3STAT1分子抑制NF-κB報告基因的活性 STAT1的過表達載體與接頭分子Myd88的過表達載體以及NF-к B報告基因載體共轉然HEK293細胞后,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,共轉染了STAT1過表達載體組可顯著降低MyD88所誘導的NF-к B報告基因的熒光素酶活性。 3、細胞質核蛋白質檢測,發(fā)現(xiàn)P65、P50的蛋白水平在質核中表達分布不同。 3.1分離提取細胞質核蛋白質,檢測P50蛋白水平變化 建立IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,分離提取細胞的質核蛋白質,利用Western Blot方法,發(fā)現(xiàn)IFN γ預刺激組與耐受組相比,P50在細胞質和細胞核中分布變化不明顯。由此,我們推測P50轉錄因子在IFN γ介導的內毒素耐受的抑制現(xiàn)象中可能是不起作用的。 3.2分離提取細胞質核蛋白質,檢測P65蛋白水平變化 建立IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的模型,分離提取細胞的質核蛋白質,利用Western Blot方法,發(fā)現(xiàn)IFNγ預刺激組與耐受組相比,在細胞質中,P65蛋白表達明顯變弱,而在細胞核中,P65蛋白水平是出現(xiàn)一定的增強。 結論： 1、IFNγ預刺激后會打破內毒素耐受的形成,STAT1分子促進IL-6的表達； 2、STAT1分子能夠與P65、P50結合,STAT1分子對NF-к B報告基因的活化起抑制作用； 3、細胞質核蛋白質分析,IFN γ預刺激組與耐受組相比,,在細胞質中,前者的P65蛋白表達明顯變弱,而在細胞核中,前者P65蛋白水平是出現(xiàn)一定的增強。由此,我們得到IFNγ介導的打破內毒素耐受形成的過程中,STAT1分子的一種特殊分子作用機制,就是STATl分子可以在細胞質中與其他蛋白轉錄因子如P65相互結合,影響其功能活化及入核情況,從而對下游的炎性因子的表達產(chǎn)生影響,這種作用機制的闡明,我們還要進一步的去研究與發(fā)現(xiàn),同時,在STAT1分子E3連接酶活性研究基礎上,我們積極探討在IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中STAT1分子對P65轉錄因子的一種泛素化作用,我們考慮到在這種現(xiàn)象中,STAT1分子所起的作用很可能是兩種機制共同作用的結果。 創(chuàng)新點及意義： 1、本研究揭示了IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中一種新的分子機制。首次證實了STAT1分子對于IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中的調節(jié)作用,而且闡明了這種作用的機制是轉錄因子STAT1分子與轉錄因子P65結合,使蛋白分子P65滯留在細胞質中,P65不能得到有效的活化并入核發(fā)揮其轉錄活性,從而使炎性因子的表達出現(xiàn)下調的情況。但是在IFN γ預刺激后,STAT1磷酸化活化,與P65的結合抑制作用減弱甚至消失,并且能夠促進P65活化入核,發(fā)揮轉錄活性,促進下游炎性因子如IL-6的表達,從而消除內毒素耐受的產(chǎn)生,同時,對于STAT1分子作用機制的研究目前來說還不是很明確,還需要本課題組相關人員進一步的研究和探討去揭示具體的作用機制。 2、本研究揭示了STAT1分子在IFNγ介導的打破內毒素耐受的形成中的重要作用機制。雖然耐受現(xiàn)象的產(chǎn)生是對機體的一種保護機制,可以防止過強的炎癥反應的發(fā)生,但是它同時也是一種免疫抑制現(xiàn)象,這會導致機體免疫反應的延滯,臨床上這對于敗血癥患者來說是誘使死亡的一個重要原因。我們的研究就為敗血癥或是其它免疫耐受現(xiàn)象的疾病的治療和預防提供了可能。同時,對于內毒素耐受及如何打破內毒素耐受的形成的研究,還需要我們進一步的深入探討。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1518073