本文關鍵詞： Numb 腸粘膜屏障 Notch信號通路 粘蛋白2 頂端連接復合體 肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈 微絲骨架　出處：《第三軍醫(yī)大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景＆目的 腸黏膜屏障包括:機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障。腸粘膜粘液屏障是上皮細胞表面覆蓋的由粘蛋白形成的水化的凝膠樣粘液，而腸黏膜上皮屏障是腸上皮本身及其緊密連接構(gòu)成的在體內(nèi)外環(huán)境之間形成一種組織學屏障，它們都具有機械性的保護作用。Numb分子因其能夠不對稱的分布到干細胞的兩個子代細胞，并能夠通過抑制Notch信號通路而使子代細胞具有不同的“命運”而引起人們的廣泛關注。既往研究顯示Numb表達在包括乳腺，肺，，睪丸，唾液腺等在內(nèi)的大多數(shù)組織上，但Numb在腸上皮細胞的表達及其功能目前還沒有報道。我們預實驗發(fā)現(xiàn)Numb并非表達在腸隱窩底干細胞上，而是普遍的表達在沿著隱窩-絨毛軸的所有上皮細胞上。既往研究發(fā)現(xiàn)，Numb能夠調(diào)節(jié)細胞的分化，調(diào)節(jié)細胞粘附，細胞遷移和細胞極性。在腸粘膜上皮細胞上，Numb是否能夠通過抑制Notch通路促進腸上皮細胞粘蛋白Muc2的分泌及腸粘膜屏障的形成，以及Numb能否通過調(diào)節(jié)腸上皮細胞間頂端連接復合體(Apicaljunctional complex，AJC）的組裝而維持腸粘膜上皮細胞屏障的完整性目前還不清楚。 圍繞以上問題，本研究揭示了Numb分子與Notch通路相關分子Hes1，Hath1的表達定位關系。通過干擾Numb分子的表達揭示了其在腸上皮細胞中對Notch通路的抑制作用，及其對腸上皮細胞LS174T細胞杯狀細胞表型的影響。利用Caco-2單層細胞模型，揭示了Numb在腸上皮單層細胞屏障形成中的作用，并揭示了其通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化及改變細胞微絲骨架的結(jié)構(gòu)影響上皮細胞屏障通透性的作用機制。 方法 1．采用RT-PCR和Western blot的方法檢測Numb-PRRL和Numb-PRRS在腸上皮細胞系和腸粘膜細胞的表達，免疫組織化學檢測Numb，Hes1，Hath1，Muc2在小鼠腸粘膜上皮細胞分布，揭示它們在腸粘膜上皮細胞的定位關系，并通過AB染色顯示其與杯狀細胞的定位關系。 2．構(gòu)建干擾質(zhì)粒pRNAT-U6.1-shRNA-Numb，轉(zhuǎn)染LS174T細胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆，熒光素酶質(zhì)粒pGa981-6檢測干擾Numb表達對Notch活性的影響，及其下游靶基因Hes1，Hath1表達的影響。 3．MTT實驗檢測干擾Numb表達對細胞增殖的影響，RT-PCR，Western blot及免疫熒光染色檢測Numb對Muc2表達的影響，PAS染色檢測Numb對LS174T細胞粘液分泌的影響。 4．RT-PCR和Western blot的方法檢測Numb在腸上皮細胞系Caco-2中的表達，免疫熒光染色檢測其與粘附連接分子ZO-1，E-cadherin及Par3的表達定位關系，免疫共沉淀檢測其與E-cadherin及Par3之間的相互作用。 5．干擾Numb分子的表達，TEER和FITC-Dextran滲透實驗檢測Numb分子在腸單層上皮細胞屏障通透性中的作用。鈣轉(zhuǎn)換實驗和TNF-a/INF-γ刺激實驗驗證Numb在AJC組裝和維持細胞連接完整中的作用。 6．免疫熒光染色檢測抑制Numb表達對鈣轉(zhuǎn)換試驗前后Caco-2細胞F-actin結(jié)構(gòu)的影響，Western blot檢測在生理和病理條件下，抑制Numb表達對細胞連接相關蛋白ZO-1，Occludin，E-cadhern，β-catenin，Claudin-1，Claudin-2的表達變化，并檢測對Caco-2細胞肌球蛋白輕鏈磷酸化水平的影響。 7．DSS誘導小鼠潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，HE染色檢測結(jié)腸組織形態(tài)變化，免疫熒光染色檢測炎癥條件下Numb在結(jié)腸上皮細胞的表達變化。 結(jié)果 1．Numb-PRRL和Numb-PRRS亞型在腸上皮細胞系和腸粘膜上皮細胞內(nèi)都有表達， Numb與Notch通路相關分子Hes1，Hath1在腸粘膜上皮細胞存在共定位關系，與Muc2和AB染色陽性的杯狀細胞也有共定位關系。 2．序列測定證實pRNAT-U6.1-shRNA-Numb成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染并經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定細胞克隆，熒光素酶質(zhì)粒pGa981-6檢測發(fā)現(xiàn)Numb能夠抑制Notch通路活性，抑制Hes1表達，促進Hath1表達。 3．Numb抑制腸上皮細胞增殖；促進LS174T表達杯狀細胞分子標志物Muc2的表達，PAS染色發(fā)現(xiàn)Numb促進LS174T細胞粘液的分泌。 4．腸上皮細胞系Caco-2表達Numb，Numb與ZO-1，E-cadherin及Par3分子共定位，IP檢測發(fā)現(xiàn)Numb與E-cadherin和Par3之間存在相互作用。 5．抑制Numb分子的表達能夠增加Caco-2上皮細胞屏障通透性。鈣轉(zhuǎn)換和TNF-a/INF-γ刺激實驗證實Numb在AJC組裝和維持細胞連接完整性中發(fā)揮作用。 6．抑制Numb表達能夠改變鈣轉(zhuǎn)換試驗前后Caco-2細胞F-actin的結(jié)構(gòu)；Numb對正常和炎癥條件下Caco-2細胞內(nèi)ZO-1，Occludin，E-cadhern，β-catenin，Claudin-1的蛋白水平?jīng)]有影響，但能夠升高Claudin-2的水平；Numb能夠抑制Caco-2細胞肌球蛋白輕鏈磷酸化。 7．HE染色發(fā)現(xiàn)DSS成功誘導小鼠結(jié)腸炎癥反應，炎癥條件下Numb在結(jié)腸上皮細胞的表達減少，且在細胞內(nèi)分布紊亂。 結(jié)論 Numb能夠通過抑制Notch通路促進腸上皮細胞粘蛋白Muc2的表達及粘液的分泌，參與腸粘膜粘液屏障的形成；同時Numb通過抑制肌球蛋白輕鏈的磷酸化，調(diào)節(jié)腸上皮細胞間AJC的組裝，維持腸粘膜上皮細胞屏障的完整性，參與腸粘膜機械屏障的形成。
[Abstract]:Background & purpose
The intestinal mucosal barrier includes: mechanical barrier, immune barrier, chemical barrier and biological barrier. Intestinal mucus barrier is formed by covering the surface of the epithelial mucin hydration gel like mucus, and intestinal epithelial barrier is the intestinal epithelial tight junction in itself and between the in vivo environment forming a tissue barrier and they all have the protective effect of.Numb for the distribution of the molecular machinery to asymmetric stem cell into two daughter cells, and through inhibition of the Notch signaling pathway to daughter cells with different "fate" and caused widespread concern. Previous studies showed that the expression of Numb in breast, lung and testis. Most of the salivary gland, tissue, but the expression of Numb in intestinal epithelial cells and its function has not been reported to date. We found that Numb is not expressed in the pre experimental intestinal crypt stem cells on the bottom But, generally expressed in all epithelial cells along the crypt villus axis. Previous studies have found that Numb can regulate cell differentiation, regulating cell adhesion, cell migration and cell polarity in epithelial cells of intestinal mucosa, whether Numb formation by secreting and intestinal mucosa barrier inhibiting Notch pathway to promote intestinal epithelial cell adhesion protein Muc2, and the Numb can pass through the apical junctional complex regulation between intestinal epithelial cells (Apicaljunctional complex, AJC) of the assembly and to maintain the integrity of the intestinal mucosal epithelial barrier is unclear.
Based on the above problems, this study reveals that Numb molecules associated with Notch pathway molecules Hes1, Hath1 expression and localization. By interfering expression of Numb molecules reveals its inhibitory effect on Notch pathway in intestinal epithelial cells, and its effect on the phenotype of intestinal epithelial cells in LS174T cells the number of goblet cells. The Caco-2 cell monolayer model, reveal the formation of Numb in the intestinal epithelial cell monolayer barrier function, and reveals its structure through inhibition of myosin light chain phosphorylation and actin cytoskeleton change effect of epithelial cell barrier permeability.
Method
1. with the methods of RT-PCR and Western blot to detect the expression of Numb-PRRL and Numb-PRRS in intestinal epithelial cells and intestinal mucosa cells, immunohistochemical detection of Numb, Hes1, Hath1, Muc2 in the distribution of epithelial cells in the intestinal mucosa of mice, reveal their relationship in the localization of intestinal epithelial cells, and through AB staining and goblet positioning the relationship between the cells.
2., we constructed interference plasmid pRNAT-U6.1-shRNA-Numb, transfected LS174T cells, and screened stable transfected cell clones. Luciferase plasmid pGa981-6 was used to detect the effect of Numb expression on Notch activity and the effect of downstream target gene Hes1 and Hath1 expression.
3.MTT assay was used to detect the effect of Numb interference on cell proliferation. RT-PCR, Western blot and immunofluorescence staining were used to detect the effect of Numb on Muc2 expression. PAS staining was used to detect the effect of Numb on mucus secretion of LS174T cells.
4.RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of Numb in intestinal epithelial cell Caco-2. Immunofluorescence staining was used to detect the relationship between the expression of Numb and ZO-1, E-cadherin and Par3, and the interaction between E-cadherin and Par3 was detected by immunoprecipitation.
5., interfere with the expression of Numb, TEER and FITC-Dextran permeability test to detect the role of Numb molecules in barrier permeability of intestinal epithelial cells. Calcium transformation test and TNF-a/INF- gamma stimulation test verify the role of Numb in AJC assembly and maintenance of cell integrity.
6. immunofluorescence staining to inhibit the expression of Numb on calcium conversion of Caco-2 cells F-actin the influence of the structure before and after experiment, Western blot detection in physiological and pathological conditions and inhibition of Numb on the expression of cell junction proteins ZO-1, Occludin, E-cadhern, beta -catenin, Claudin-1, Claudin-2 expression, and detect the effect on Caco-2 cells of myosin light chain phosphorylation the level.
7.DSS induced animal model of ulcerative colitis in mice, HE coloring was used to detect colonic tissue morphology, and immunofluorescence staining was used to detect the expression of Numb in colonic epithelial cells under inflammatory condition.
Result
1.Numb-PRRL and Numb-PRRS subtypes are expressed in intestinal epithelial cells and intestinal epithelial cells. Numb and Notch pathway related molecules Hes1 and Hath1 have colocalization relationship in intestinal epithelial cells, and have co localization with Muc2 and AB stained goblet cells.
2. sequencing confirmed that pRNAT-U6.1-shRNA-Numb was successfully constructed, transfected and screened stable cell clone by G418. Luciferase plasmid pGa981-6 showed that Numb could inhibit Notch pathway activity, inhibit Hes1 expression and promote Hath1 expression.
3.Numb inhibited the proliferation of intestinal epithelial cells, and promoted LS174T expression of Muc2, a marker of goblet cell. PAS staining showed that Numb promoted mucus secretion in LS174T cells.
4. the intestinal epithelial cell line Caco-2 expressed Numb, and Numb was Co located with ZO-1, E-cadherin and Par3 molecules. IP detected the interaction between Numb and E-cadherin and Par3.
5. inhibition of Numb expression can increase the permeability of Caco-2 epithelial barrier. Calcium transformation and TNF-a/INF- gamma stimulation test confirm that Numb plays a role in AJC assembly and maintenance of cell integrity.
6. inhibition of Numb expression can change the structure of Caco-2 F-actin cell calcium conversion test before and after Numb; on ZO-1, Caco-2 cells in normal and inflammatory conditions, Occludin, E-cadhern, beta -catenin, did not affect the protein level of Claudin-1, but can increase the level of Claudin-2; Numb can inhibit Caco-2 cell myosin light chain phosphorylation.
7.HE staining showed that DSS successfully induced colonic inflammation in mice. The expression of Numb in colonic epithelial cells decreased in inflammatory conditions and was disordered in the cells.
conclusion
Numb can inhibit the Notch pathway to promote the secretion of intestinal epithelial cells and mucus expression of mucin Muc2, involved in the formation of intestinal mucus barrier; at the same time Numb by inhibiting the phosphorylation of myosin light chain assembly, regulation of intestinal epithelial cells AJC, to maintain the integrity of intestinal epithelial cell barrier, involved in the formation of intestinal mucosal mechanical barrier.

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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