發(fā)布時間：2018-02-14 02:51

  本文關(guān)鍵詞： 福氏志賀氏菌 IpaH9.8 基因敲除 雙間電泳 磷酸化　出處：《吉林大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：志賀氏菌屬(Shigella spp.)又稱為痢疾桿菌,是一類不形成芽孢的革蘭氏陰性致病菌,臨床上可引起細菌性痢疾。志賀氏菌屬共有四個種48個血清型,包括痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigella sonnei)和鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)。世界各地都有菌痢流行,全球每年的發(fā)病人數(shù)達到1.6億,其中95%以上的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家,我國每年菌痢的發(fā)病人數(shù)在40萬以上,僅次于肝炎和結(jié)核。其中,福氏志賀氏菌是發(fā)展中國家尤其是我國引起細菌性痢疾的主要志賀氏菌種。細菌性痢疾在衛(wèi)生條件較好的發(fā)達國家也時有爆發(fā),在戰(zhàn)時和有自然災害的情況下發(fā)病率更高,嚴重影響作戰(zhàn)部隊的戰(zhàn)斗力,也會對災難救援工作產(chǎn)生極大不利影響。痢疾雖有藥物治療,但易轉(zhuǎn)為慢性或長期帶菌,且抗藥性日趨嚴重。目前痢疾的治療主要是依靠抗生素,然而耐藥和多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn),增加了痢疾防治的難度,因此開展對志賀氏菌的遺傳機制和致病機理研究,對開發(fā)研制有效的疫苗和新藥具有重要價值。 志賀氏菌感染人的腸道引起細菌性痢疾,其致病性依賴于Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。志賀氏菌與宿主上皮細胞接觸后,激活Ⅲ型分泌系統(tǒng),將毒力蛋白直接注入宿主細胞內(nèi),這些蛋白可影響細胞的功能,如使細胞皺膜、改變肌動蛋白骨架、激活宿主細胞信號通路、誘導巨噬細胞凋亡等。Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的蛋白往往可使細菌在宿主細胞內(nèi)存活又不過分傷及宿主,由此可見細菌與宿主在進化的過程中,細菌致病機制和宿主細胞存活之間具有一定的協(xié)調(diào)性。目前對志賀氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)及效應子蛋白功能的研究已成為其致病性研究的熱點。志賀氏菌的IpaH家族蛋白作為Ⅲ型分泌系統(tǒng)的效應子,其基因存在于染色體和毒力大質(zhì)粒上。在福氏2a301株的毒力大質(zhì)粒上存在5個ipaH基因的拷貝,分別是ipaH1.4、ipaH2.5、ipaH4.5、ipaH7.8、ipaH9.8。研究發(fā)現(xiàn),IpaH9.8能下調(diào)宿主細胞內(nèi)前炎性因子的表達,在志賀氏菌感染時明顯抑制炎癥反應,但目前其詳細的功能及在志賀氏菌中的作用還不清楚。 基因敲除是功能基因組學研究中的一個重要技術(shù)平臺,也是病原微生物致病機理研究中必不可少的手段之一。在本研究中,我們利用λ-Red重組技術(shù)將福氏2a301株ipaH9.8基因敲除,然后分析突變株與野生株之間的表型與功能差異,獲得與該基因功能相關(guān)的一些信息,從而達到闡述該蛋白功能的目的。首先將九噬菌體Red重組系統(tǒng)稍加改進,成功地敲除了志賀氏菌福氏2a301株的ipaH9.8基因,并利用低拷貝質(zhì)粒構(gòu)建了回復株,并分別用PCR和RT-PCR進行了驗證；然后進一步測定野生株、缺失突變株和回復株生長曲線、生化反應,細胞侵襲實驗、豚鼠角膜結(jié)膜感染實驗、細胞因子檢測和小鼠肺感染實驗對野生株、缺失突變株和回復株的毒力表型進行比較分析。結(jié)果表明：野生株、缺失突變株和回復株的生長曲線基本一致,缺失突變株與野生株的生理生化反應沒有明顯差異,說明IpaH9.8對志賀氏菌的生長和基本生化代謝無影響。野生株、缺失突變株和回復株均能夠侵襲進入Hela細胞和鼠巨噬細胞J774.A.1,使細胞核破裂,造成細胞死亡：細菌侵襲細胞后涂板計數(shù),野生株、缺失突變株與回復株侵襲進入Hela細胞和J774.A.1細胞內(nèi)的細菌數(shù)量無顯著性差異,表明野生株、缺失突變株和回復株對Hela細胞和巨噬細胞的侵襲性沒有明顯區(qū)別,說明缺失ipaH9.8基因?qū)χ举R氏菌的侵襲能力影響不大。野生株、缺失突變株與回復株均能夠引起豚鼠角膜結(jié)膜炎癥反應,但缺失突變株的炎癥反應更加強烈,推測IpaH9.8可能抑制宿主的炎癥應答；因此,我們利用ELISA方法檢測細菌侵襲細胞后的培養(yǎng)上清中細胞因子TNF-a和IL-1β的分泌情況,結(jié)果表明,與缺失突變株相比,野生株和回復株感染鼠巨噬細胞J774.A.1后明顯抑制細胞產(chǎn)生TNF-a和IL-1β的能力；通過小鼠肺感染模型進一步證實了IpaH9.8能夠抑制宿主的炎癥反應。 我們利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對野生株、缺失突變株和回復株進行了全菌體蛋白的比較蛋白組學研究。在蛋白質(zhì)組的比較分析中我們發(fā)現(xiàn),共鑒定出43個蛋白點,對應23種蛋白質(zhì),與野生株和回復株相比,缺失突變株表達上調(diào)的蛋白為10個,表達下調(diào)的有15個,并且有1個蛋白對發(fā)生了位置的遷移。其中應激蛋白DnaK和GroEL表達下調(diào),蛋白解聚分子伴侶的表達增加。最顯著的差異是ipaH9.8基因的缺失引起了很多外膜蛋白的表達變化,包括NmpC、OmpF、OmpA、OmpA前體、OmpMxiD等,這些蛋白的變化都表明了IpaH9.8在一定程度上影響著志賀氏菌的侵襲能力和宿主的免疫反應。此外,還發(fā)現(xiàn)IpaH9.8誘導了長鏈脂肪酸外膜蛋白轉(zhuǎn)運亍磷酸化與非磷酸化形式之問的轉(zhuǎn)變。這些結(jié)果加深了我們對志賀氏菌效直至白IpaH9.8的認識,有助于志賀氏菌致病機理的進一步研究： 上述研究中,生長曲線的測定和生化反應實驗,深化了對褐氏志賀氏菌生理學特性的了解：細胞侵襲實驗,為全面深入分析志賀氏菌的侵襲機制提供了掀其重要的線索；豚鼠角膜結(jié)膜感染實驗的結(jié)果,為志賀氏菌免疫逃逸的研究奠定了基礎(chǔ)。此外,比較蛋白質(zhì)組學的研究設(shè)計,也拓展了篩選毒力相關(guān)蛋白的研究思路。研究中采用的技術(shù)改進以及獲得的寶貴經(jīng)驗也為深入開展志賀氏菌致病機理的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Shigella spp . Also known as dysentery bacillus , is a kind of Gram - negative pathogenic bacteria which do not form spore , which can cause bacterial dysentery in clinic . There are four kinds of serotypes of Shigella , including Shigella , Shigella , Shigella , Shigella and Shigella boydii . dysentery is prevalent in various parts of the world , the number of deaths worldwide reaches 160 million , of which more than 95 percent of deaths occur in developing countries , and the incidence of bacterial dysentery in China is more than 400,000 , which is secondary to hepatitis and tuberculosis . It is found that IpaH family proteins can regulate the expression of pro - inflammatory factors in host cells . In this study , we used 位 - Red recombination technique to knock out ipaH9 . 8 gene and then analyze the phenotype and function difference between mutant strain and wild strain . In this paper , we found that 43 protein spots were identified by two - dimensional electrophoresis and mass spectrometry . In the comparative analysis of protein groups , 43 protein spots were identified and there were 23 proteins . In the above research , the growth curve and the biochemical reaction experiment have deepened the understanding of the physiological characteristics of Shiga shigellae : the cell invasion experiment has provided an important clue for the thorough analysis of the invasion mechanism of Shigella . In addition , the research design of the guinea pig corneal conjunctival infection experiment lays a foundation for the research on the immune escape of Shigella . In addition , the research on the technology improvement and the valuable experience adopted in the study lays a solid foundation for further research on the pathogenesis of Shigella .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張繼瑜,劉紅,張笑兵,楊帆,楊國威,侯云德,金奇,楊劍,沈巖;志賀菌福氏2a毒力大質(zhì)粒DNA全序列的測定與基因分析[J];中國科學(C輯:生命科學);2003年01期

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本文編號：1509707